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公開番号2025072213
公報種別公開特許公報(A)
公開日2025-05-09
出願番号2023182814
出願日2023-10-24
発明の名称形質転換体及びそれを用いるm-アミノフェノールの製造方法
出願人公益財団法人地球環境産業技術研究機構,帝人株式会社
代理人弁理士法人池内アンドパートナーズ
主分類C12N 1/21 20060101AFI20250430BHJP(生化学;ビール;酒精;ぶどう酒;酢;微生物学;酵素学;突然変異または遺伝子工学)
要約【課題】 m-アミノフェノールを生物学的に生産可能な形質転換体を提供する。
【解決手段】
一態様において、アントラニル酸産生能を有する微生物宿主に、アントラニル酸を水酸化して2-アミノ-4-ヒドロキシ安息香酸を生成する活性を有する酵素をコードする遺伝子(A)と、2-アミノ-4-ヒドロキシ安息香酸脱炭酸活性を有する酵素をコードする遺伝子(B)とが発現可能に導入されて得られる、m-アミノフェノールを製造するための形質転換体に関する。その他の態様において、アントラニル酸産生能を有する微生物宿主に、シトクロムP450をコードするcyp遺伝子と、シトクロムP450レダクターゼをコードするcpr遺伝子と、脱炭酸酵素をコードするubiD遺伝子又はsdc遺伝子とが、発現可能に導入されて得られる、m-アミノフェノールを製造するための形質転換体に関する。
【選択図】図1
特許請求の範囲【請求項１】
アントラニル酸産生能を有する微生物宿主に、下記遺伝子（Ａ）及び（Ｂ）が発現可能に導入されて得られる、ｍ－アミノフェノールを製造するための形質転換体。
（Ａ）アントラニル酸を水酸化して２－アミノ－４－ヒドロキシ安息香酸を生成する活性を有する酵素をコードする遺伝子。
（Ｂ）２－アミノ－４－ヒドロキシ安息香酸脱炭酸活性を有する酵素をコードする遺伝子。
続きを表示（約 3,700 文字）【請求項２】
前記遺伝子（Ａ）は、Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ属、Ｃｏｃｈｌｉｏｂｏｌｕｓ属、Ｐｈａｎｅｒｏｃｈａｅｔｅ属、Ｎｅｕｒｏｓｐｏｒａ属、及びＲｈｏｄｏｔｏｒｕｌａ属からなる群から選択される少なくとも一つの由来のものである、請求項１に記載の形質転換体。
【請求項３】
前記遺伝子（Ａ）は、少なくとも、下記の（Ａ１）、（Ａ２）及び（Ａ３）からなる群から選択される少なくとも一つの遺伝子と、下記の（Ａ７）、（Ａ８）及び（Ａ９）からなる群から選択される少なくとも一つの遺伝子とを含む、請求項１に記載の形質転換体。
（Ａ１）配列番号７２、配列番号７３、配列番号７４、配列番号７５、配列番号７６又は配列番号７７で示されるアミノ酸配列を有するポリペプチドをコードする遺伝子；
（Ａ２）配列番号７２、配列番号７３、配列番号７４、配列番号７５、配列番号７６又は配列番号７７で示されるアミノ酸配列と９０％以上の同一性を有するアミノ酸配列を有するポリペプチドをコードする遺伝子であって、遺伝子（Ａ７）、（Ａ８）又は（Ａ９）によってコードされるポリペプチドと相俟って、アントラニル酸を水酸化して２－アミノ－４－ヒドロキシ安息香酸を生成する活性を有するポリペプチドをコードする遺伝子；
（Ａ３）配列番号７２、配列番号７３、配列番号７４、配列番号７５、配列番号７６又は配列番号７７で示されるアミノ酸配列を有するポリペプチドをコードする遺伝子と相補的な塩基配列を有する遺伝子と、ストリンジェントな条件下でハイブリダイズする遺伝子であって、遺伝子（Ａ７）、（Ａ８）又は（Ａ９）によってコードされるポリペプチドと相俟って、アントラニル酸を水酸化して２－アミノ－４－ヒドロキシ安息香酸を生成する活性を有するポリペプチドをコードする遺伝子；
（Ａ７）配列番号７８、配列番号７９、配列番号８０、配列番号８１、配列番号８２又は配列番号８３で示されるアミノ酸配列を有するポリペプチドをコードする遺伝子；
（Ａ８）配列番号７８、配列番号７９、配列番号８０、配列番号８１、配列番号８２又は配列番号８３で示されるアミノ酸配列と９０％以上の同一性を有するアミノ酸配列を有するポリペプチドをコードする遺伝子であって、遺伝子（Ａ１）、（Ａ２）又は（Ａ３）によりコードされるポリペプチドに電子を供与する機能を有するポリペプチドをコードする遺伝子；
（Ａ９）配列番号７８、配列番号７９、配列番号８０、配列番号８１、配列番号８２又は配列番号８３で示されるアミノ酸配列を有するポリペプチドをコードする遺伝子と相補的な塩基配列を有する遺伝子と、ストリンジェントな条件下でハイブリダイズする遺伝子であって、遺伝子（Ａ１）、（Ａ２）又は（Ａ３）によりコードされるポリペプチドに電子を供与する機能を有するポリペプチドをコードする遺伝子。
【請求項４】
前記遺伝子（Ａ）は、少なくとも、下記の（Ａ４）、（Ａ５）及び（Ａ６）からなる群から選択される少なくとも一つの遺伝子と、下記の（Ａ１０）、（Ａ１１）及び（Ａ１２）からなる群から選択される少なくとも一つの遺伝子とを含む、請求項１に記載の形質転換体。
（Ａ４）配列番号１、配列番号４、配列番号７、配列番号１０、配列番号１３又は配列番号１６で示される塩基配列を有する遺伝子；
（Ａ５）配列番号１、配列番号４、配列番号７、配列番号１０、配列番号１３又は配列番号１６で示される塩基配列と９０％以上の同一性を有する塩基配列を有する遺伝子であって、遺伝子（Ａ１０）、（Ａ１１）又は（Ａ１２）によってコードされるポリペプチドと相俟って、アントラニル酸を水酸化して２－アミノ－４－ヒドロキシ安息香酸を生成する活性を有するポリペプチドをコードする遺伝子；
（Ａ６）配列番号１、配列番号４、配列番号７、配列番号１０、配列番号１３又は配列番号１６で示される塩基配列を有する遺伝子と相補的な塩基配列を有する遺伝子と、ストリンジェントな条件下でハイブリダイズする遺伝子であって、遺伝子（Ａ１０）、（Ａ１１）又は（Ａ１２）によってコードされるポリペプチドと相俟って、アントラニル酸を水酸化して２－アミノ－４－ヒドロキシ安息香酸を生成する活性を有するポリペプチドをコードする遺伝子；
（Ａ１０）配列番号１９、配列番号２２、配列番号２５、配列番号２８、配列番号３１又は配列番号３４で示される塩基配列を有する遺伝子；
（Ａ１１）配列番号１９、配列番号２２、配列番号２５、配列番号２８、配列番号３１又は配列番号３４で示される塩基配列を有する遺伝子と９０％以上の同一性を有する塩基配列を有する遺伝子であって、遺伝子（Ａ４）、（Ａ５）又は（Ａ６）によりコードされるポリペプチドに電子を供与する機能を有するポリペプチドをコードする遺伝子；
（Ａ１２）配列番号１９、配列番号２２、配列番号２５、配列番号２８、配列番号３１又は配列番号３４で示される塩基配列を有する遺伝子と相補的な塩基配列を有する遺伝子と、ストリンジェントな条件下でハイブリダイズする遺伝子であって、遺伝子（Ａ４）、（Ａ５）又は（Ａ６）によりコードされるポリペプチドに電子を供与する機能を有するポリペプチドをコードする遺伝子。
【請求項５】
前記遺伝子（Ｂ）は、Ｅｎｔｅｒｏｂａｃｔｅｒ属、Ｐａｎｔｏｅａ属、Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ属、Ｃｉｔｒｏｂａｃｔｅｒ属、Ｃｕｔａｎｅｏｔｒｉｃｈｏｓｐｏｒｏｎ属、及びＡｕｒｅｏｂａｓｉｄｉｕｍ属からなる群から選択される少なくとも一つの由来のものである、請求項１に記載の形質転換体。
【請求項６】
前記遺伝子（Ｂ）は、少なくとも、下記の（Ｂ１）、（Ｂ２）及び（Ｂ３）からなる群から選択される遺伝子である、請求項１に記載の形質転換体。
（Ｂ１）配列番号８４、配列番号８５、配列番号８６、配列番号８７、配列番号８８、配列番号８９、配列番号９０、配列番号９１、配列番号９２、配列番号９３又は配列番号９４で示されるアミノ酸配列を有するポリペプチドをコードする遺伝子；
（Ｂ２）配列番号８４、配列番号８５、配列番号８６、配列番号８７、配列番号８８、配列番号８９、配列番号９０、配列番号９１、配列番号９２、配列番号９３又は配列番号９４で示されるアミノ酸配列と９０％以上の同一性を有するアミノ酸配列を有するポリペプチドをコードする遺伝子であって、２－アミノ－４－ヒドロキシ安息香酸脱炭酸活性を有するポリペプチドをコードする遺伝子；
（Ｂ３）配列番号８４、配列番号８５、配列番号８６、配列番号８７、配列番号８８、配列番号８９、配列番号９０、配列番号９１、配列番号９２、配列番号９３又は配列番号９４で示されるアミノ酸配列を有するポリペプチドをコードする遺伝子と相補的な塩基配列を有する遺伝子と、ストリンジェントな条件下でハイブリダイズする遺伝子であって、２－アミノ－４－ヒドロキシ安息香酸脱炭酸活性を有するポリペプチドをコードする遺伝子。
【請求項７】
前記遺伝子（Ｂ）は、少なくとも、下記の（Ｂ４）、（Ｂ５）及び（Ｂ６）からなる群から選択される遺伝子である、請求項１に記載の形質転換体。
（Ｂ４）配列番号９５、配列番号９６、配列番号９７、配列番号９８、配列番号９９、配列番号１００、配列番号１０１、配列番号１０２、配列番号１０３、配列番号６４又は配列番号６７で示される塩基配列を有する遺伝子；
（Ｂ５）配列番号９５、配列番号９６、配列番号９７、配列番号９８、配列番号９９、配列番号１００、配列番号１０１、配列番号１０２、配列番号１０３、配列番号６４又は配列番号６７で示される塩基配列と９０％以上の同一性を有する塩基配列を有する遺伝子であって、２－アミノ－４－ヒドロキシ安息香酸脱炭酸活性を有するポリペプチドをコードする遺伝子；
（Ｂ６）配列番号９５、配列番号９６、配列番号９７、配列番号９８、配列番号９９、配列番号１００、配列番号１０１、配列番号１０２、配列番号１０３、配列番号６４又は配列番号６７で示される塩基配列を有する遺伝子と相補的な塩基配列を有する遺伝子と、ストリンジェントな条件下でハイブリダイズする遺伝子であって、２－アミノ－４－ヒドロキシ安息香酸脱炭酸活性を有するポリペプチドをコードする遺伝子。
【請求項８】
アントラニル酸産生能を有する微生物宿主に、
シトクロムＰ４５０をコードするcyp遺伝子と、
シトクロムＰ４５０レダクターゼをコードするcpr遺伝子と、
脱炭酸酵素をコードするubiD遺伝子又はsdc遺伝子とが、
発現可能に導入されて得られる、ｍ－アミノフェノールを製造するための形質転換体。
【請求項９】
請求項１～８のいずれかに記載の形質転換体を培養してｍ－アミノフェノールを生産させる工程を含む、ｍ－アミノフェノールの製造方法。

発明の詳細な説明【技術分野】
【０００１】
本開示は、ｍ－アミノフェノール生産技術に関する。
本開示は、一態様において、特定の遺伝子操作が施された形質転換体、及びこの形質転換体を用いたｍ－アミノフェノールの製造技術に関する。
続きを表示（約 1,600 文字）【背景技術】
【０００２】
ｍ－アミノフェノール（ＣＡＳ番号：５９１－２７－５。３－アミノフェノール、３－アミノ－１－ヒドロキシベンゼン、３－ヒドロキシアニリンなども同義。）は、アラミド繊維の原料などに用いられる芳香族化合物である。
ｍ－アミノフェノールの前駆体であるアントラニル酸（ＣＡＳ番号：１１８－９２－３。アントラニレート、２－アミノ安息香酸なども同義。）は、微生物による発酵法により、糖類から生産することもできる（例えば、特許文献１及び特許文献２など）。
【先行技術文献】
【特許文献】
【０００３】
特開平５－９４号公報
特表平６－５００６９５号公報
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００４】
本開示は、ｍ－アミノフェノールを生物学的に生産可能な形質転換体、及び当該形質転換体を用いてｍ－アミノフェノールを製造する方法を提供する。
【課題を解決するための手段】
【０００５】
本開示は、一態様において、アントラニル酸産生能を有する微生物宿主に、アントラニル酸を水酸化して２－アミノ－４－ヒドロキシ安息香酸を生成する活性を有する酵素をコードする遺伝子（Ａ）と、２－アミノ－４－ヒドロキシ安息香酸脱炭酸活性を有する酵素をコードする遺伝子（Ｂ）とが発現可能に導入されて得られる、ｍ－アミノフェノールを製造するための形質転換体に関する。
【０００６】
本開示は、その他の態様において、アントラニル酸産生能を有する微生物宿主に、シトクロムＰ４５０をコードするcyp遺伝子と、シトクロムＰ４５０レダクターゼをコードするcpr遺伝子と、脱炭酸酵素をコードするubiD遺伝子又はsdc遺伝子とが発現可能に導入されて得られる、ｍ－アミノフェノールを製造するための形質転換体に関する。
【０００７】
本開示は、その他の態様において、本開示の形質転換体を培養してｍ－アミノフェノールを生産させる工程を含むｍ－アミノフェノールの製造方法に関する。
【発明の効果】
【０００８】
本開示によれば、糖類を原料としてｍ－アミノフェノールを生物学的に生産可能な新たな形質転換体、及び当該形質転換体を用いたｍ－アミノフェノールの製造方法を提供できる。
【図面の簡単な説明】
【０００９】
図１は、本開示の形質転換体におけるｍ－アミノフェノール生成を模式的に示す図である。
図２は、本開示の形質転換体の一形態におけるｍ－アミノフェノールの生合成経路を説明するための全体代謝経路図である。
【発明を実施するための形態】
【００１０】
本開示は、アントラニル酸産生能を有する微生物宿主に、アントラニル酸を水酸化して２－アミノ－４－ヒドロキシ安息香酸を生成する活性を有する酵素をコードする遺伝子（Ａ）と、２－アミノ－４－ヒドロキシ安息香酸脱炭酸活性を有する酵素をコードする遺伝子（Ｂ）とを発現可能に導入することで、糖類を原料としてｍ－アミノフェノールを生物学的に生産可能な形質転換体が得られることを、本発明者らが見出したことに基づく。
また、本開示は、アントラニル酸産生能を有する微生物宿主に、シトクロムＰ４５０（cytochrome P450）をコードするcyp遺伝子と、シトクロムＰ４５０レダクターゼ（cytochrome P450 reductase、略称：CYP reductase、ＥＣ番号：EC 1.6.2.4）をコードするcpr遺伝子と、脱炭酸酵素をコードするubiD遺伝子又はsdc遺伝子とを発現可能に導入することで、糖類を原料としてｍ－アミノフェノールを生物学的に生産可能な形質転換体が得られることを、本発明者らが見出したことに基づく。
（【００１１】以降は省略されています）

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