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公開番号2025094074
公報種別公開特許公報(A)
公開日2025-06-24
出願番号2025043070,2021548992
出願日2025-03-18,2020-09-24
発明の名称肝細胞の可塑性誘導法
出願人公立大学法人横浜市立大学
代理人個人,個人
主分類C12N 5/10 20060101AFI20250617BHJP(生化学;ビール;酒精;ぶどう酒;酢;微生物学;酵素学;突然変異または遺伝子工学)
要約【課題】肝芽細胞の作製方法、肝芽細胞、および肝細胞の作製方法を提供する。
【解決手段】FGF2、HGF、オンコスタチンM及びデキサメタゾンを含む無血清培地中でiPS細胞由来の内胚葉細胞を培養し、肝芽細胞に分化させる工程を含む、肝芽細胞の作製方法であって、一態様として、培地中にさらにニコチンアミドを含む、あるいは、無血清培地が無血清分化培地である、あるいは、iPS細胞がヒト由来である、あるいは、iPS細胞由来の内胚葉細胞の培養期間が5日以上10日未満である、肝芽細胞の作製方法。
【選択図】図2-1
特許請求の範囲【請求項１】
FGF2、HGF、オンコスタチンM及びデキサメタゾンを含む無血清培地中でiPS細胞由来の内胚葉細胞を培養し、肝芽細胞に分化させる工程を含む、肝芽細胞の作製方法。
続きを表示（約 570 文字）【請求項２】
培地中に、さらにニコチンアミドを含む、請求項１に記載の方法。
【請求項３】
無血清培地が無血清分化培地（SFD）である、請求項１に記載の方法。
【請求項４】
iPS細胞がヒト由来である、請求項１に記載の方法。
【請求項５】
培地中に、さらにニコチンアミドを含む、請求項１に記載の方法。
【請求項６】
iPS細胞由来の内胚葉細胞の培養期間が５日以上１０日未満である、請求項１に記載の方法。
【請求項７】
マトリゲルまたはラミニンでコーティングしたプレート上でiPS細胞由来の内胚葉細胞を培養する請求項１に記載の方法。
【請求項８】
iPS細胞由来の内胚葉細胞は、B27、WNT3A及びアクチビンAを含有する培地中でiPS細胞を培養して内胚葉細胞に分化させた細胞である、請求項１に記載の方法。
【請求項９】
B27、WNT3A及びアクチビンAを含有する培地に、0日目にY-27632を添加し、1日目から3日目までNaBを添加し、iPS細胞を７日間培養する請求項８に記載の方法。
【請求項１０】
肝芽細胞がTTRを発現している細胞である、請求項１に記載の方法。
（【請求項１１】以降は省略されています）
発明の詳細な説明【技術分野】
【０００１】
本発明は、肝細胞の可塑性誘導法に関する。
続きを表示（約 8,300 文字）【背景技術】
【０００２】
肝臓組織の約70%は肝細胞である。肝細胞の可塑性は、肝再生能力を維持するための大事な役割を果している(Nat Cell Biol.18(3):238-45(2016)（非特許文献１）; Hepatology.64(6):2244-6 (2016)（非特許文献２)）。すなわち、マウスにおいて肝障害が生じると成熟肝細胞は増殖性のある肝前駆細胞に転換し、欠損した肝細胞や胆管細胞を修復することが判明している(Cell Stem Cell.15(3):340-9(2014)（非特許文献３）; Cell Stem Cell.15(5):605-18(2014)（非特許文献４）; Cell. 157,1324-38(2014)（非特許文献５）; Genes Dev.27(7):719-24(2013)（非特許文献６）)。また、ヒトの肝硬変時においても同様の肝前駆細胞は検出されている(Cell Stem Cell.23(1):114-22(2018)（非特許文献７）)。さらに、肝臓再生能力は肝細胞の老化状態と関連があり、高齢ドナー由来の肝移植片は、その生着率が顕著に悪いことも示されている(J Hepatol.70(4):745-58 (2019)（非特許文献８）; J Hepatol.57(2):288-96 (2012)（非特許文献９）)。
【０００３】
T. Ochiyaらは、in vitroにおいてマウスおよびラット肝細胞に対して小分子化合物（YAC, Y-27632, A83-01, CHIR99021）を作用させることにより、成熟肝細胞から増殖能を有する肝前駆細胞を誘導し、20継代以上の培養が可能であることを示している（Cell Stem Cell. 20(1):41-55 (2017)（非特許文献１０））。その後、多くの研究グループがこの培養技術をヒト肝細胞に応用することを試みた。しかしながら、ヒト肝細胞と齧歯動物由来肝細胞の性質の違いは大きく、ヒト肝前駆細胞の誘導を試みても3継代以上の培養は不可能であった（Cell Stem Cell. 23(6):806-819,2018（非特許文献１１）; Cell Research.29,8-22, 2019（非特許文献１２）; J Hepatol.70(1):97-107,2019（非特許文献１３））。また、増殖性のみならず、ヒト肝細胞と胆管細胞へ分化しうる多分化能も維持できておらず、ヒト肝細胞を対象とした可塑性制御に基づく肝前駆細胞の誘導は実現できていなかった。
【先行技術文献】
【非特許文献】
【０００４】
Nat Cell Biol.18(3):238-45(2016)
Hepatology.64(6):2244-6 (2016)
Cell Stem Cell.15(3):340-9(2014)
Cell Stem Cell.15(5):605-18(2014)
Cell. 157,1324-38(2014)
Genes Dev.27(7):719-24(2013)
Cell Stem Cell.23(1):114-22(2018)
J Hepatol.70(4):745-58 (2019)
J Hepatol.57(2):288-96 (2012)
Cell Stem Cell. 20(1):41-55 (2017)
Cell Stem Cell. 23(6):806-819,2018
Cell Research.29,8-22, 2019
J Hepatol.70(1):97-107,2019
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００５】
従来技術には以下の欠点がある。
１．齧歯動物由来肝細胞からの肝前駆細胞の誘導方法は、ヒト細胞へ応用することができない。
２．従来法で誘導した肝前駆細胞には、高い増殖能と多分化能がない。
３．ヒト肝細胞の可塑性や老化の制御技術がない。
【０００６】
本発明は、これらの欠点を克服することを目的とする。
【課題を解決するための手段】
【０００７】
本発明者らは、iPS細胞由来肝細胞の新規誘導法を見出し、老化マーカーと特徴を徐々に蓄積しながら肝機能を長期にわたって維持できる肝細胞を作製することに成功した。
【０００８】
また、本発明者らは、齧歯動物由来肝細胞と違い、ヒト肝細胞の可塑性はFGF2-MAPK-EZH2軸によって調節されていることを新たに発見した。すなわち、FGF2添加によりEZH2の転写活性を上昇させることにより、ヒト肝細胞から増殖能・多分化能（肝細胞と胆管細胞へ分化しうる両能性）を有した肝前駆細胞に転換することが可能である一方、老化した肝細胞においては、この可塑性は障害されていることを見出した。
【０００９】
さらに、本発明者らは、ヒストンアセチル化の低下がこの老化細胞における可塑性獲得の阻害要因であることを明らかにした。そして、ヒストン脱アセチル化酵素（HDAC）を選択的に阻害することより、ヒトiPS細胞由来の老化したヒト肝細胞や高齢者（78歳）由来の初代ヒト肝細胞においても可塑性を改善することが可能であることを見出した。これらの老化細胞から人為的に誘導した肝前駆細胞は、生体外培養系において２０回以上の継代培養が可能であり、肝細胞の大量製造への応用が可能である。
【００１０】
本発明の要旨は以下の通りである。
（１）FGFファミリーのメンバー、HGF、IL6ファミリーのメンバー及びデキサメタゾンの存在下で、内胚葉細胞を肝細胞に分化させることを含む、肝細胞の作製方法。
（２）FGFファミリーのメンバーが、FGF2、FGF1、FGF3、FGF4、FGF5、FGF6、FGF7、FGF8、FGF9、FGF10、FGF11、FGF12、FGF13、FGF14、FGF16、FGF17、FGF18、FGF19、FGF20、FGF21、FGF22及びFGF23からなる群より選択される少なくとも１つである（１）記載の方法。
（３）IL6ファミリーのメンバーが、オンコスタチン、IL-11、IL-27、IL-35、IL-39、LIF、CT-1、CNTF及びCLCF1からなる群より選択される少なくとも１つである（１）又は（２）に記載の方法。
（４）内胚葉細胞が多能性幹細胞から分化した細胞である（１）～（３）のいずれかに記載の方法。
（５）内胚葉細胞がヒト由来である（１）～（４）のいずれかに記載の方法。
（６）（１）～（５）のいずれかに記載の方法により作製され、生体外の単層培養で12日以上アルブミンの分泌能を維持し、生存できる肝細胞。
（７）12日以上アルブミンの分泌能以外の肝細胞としての機能も持って、生存できる（６）記載の肝細胞。
（８）アルブミンの分泌能以外の肝細胞としての機能が、薬物代謝能、インドシアニングリーンの取込みおよび排出、グリコーゲン貯蔵、低密度リポタンパク質の取込み及び遺伝子発現からなる群より選択される少なくとも１つである（７）記載の肝細胞。
（９）老化の特徴を示す（６）～（８）のいずれかに記載の肝細胞。
（１０）老化の特徴が、細胞容量の増大、老化関連遺伝子の発現、炎症性応答の増大、DNA損傷、細胞内活性酸素種レベルの増大、細胞老化関連βガラクトシダーゼレベルの増大、エピジェネティック変化、テロメアの長さの短小化及びミトコンドリア機能の低下からなる群より選択される少なくとも１つである（９）記載の肝細胞。
（１１）FGFファミリーのメンバーの存在下で、肝細胞を培養することを含む、肝前駆細胞の作製方法。
（１２）FGFファミリーのメンバー及びヒストン高アセチル化をもたらす薬剤の存在下で、肝細胞を培養することを含む（１１）記載の方法。
（１３）FGFファミリーのメンバーが、FGF2、FGF1、FGF3、FGF4、FGF5、FGF6、FGF7、FGF8、FGF9、FGF10、FGF11、FGF12、FGF13、FGF14、FGF16、FGF17、FGF18、FGF19、FGF20、FGF21、FGF22及びFGF23からなる群より選択される少なくとも１つである（１１）又は（１２）記載の方法。
（１４）ヒストン高アセチル化をもたらす薬剤がヒストン脱アセチル化酵素阻害剤である（１２）又は（１３）記載の方法。
（１５）ヒストン脱アセチル化酵素阻害剤が、Trichostatin A、Tacedinaline (CI-994)、M344、ITSA-1、Sodium valproate、Sodium 4-phenylbutuyrate、Sodium Butyrate (NaB)、valproic acid (VPA)、Abexinostat (PCI-24781)、Belinostat(PXD101)、Citarinostat (ACY-241)、Dacinostat (LAQ824)、Depudecin、Domatinostat (4SC-202)、Droxinostat、Entinostat (MS-275, SNDX-275)、Fimepinostat (CUDC-907)、Givinostat (ITF2357)、Mocetinostat (MGCD0103)、Nexturastat A、Panobinostat (LBH-589,NVP-LBH589)、Pracinostat (SB939)、Quisinostat (JNJ-26481585) 2HCl、Resminostat、Ricolinostat (ACY-1215)、Tucidinostat (Chidamide)、Vorinostat (SAHA)、ACY-738、Apicidin、AR-42、BG45、BML-210、BRD73954、CAY10603、CUDC-101、Curcumin、Depudecin、H1388、HC Toxin、HPOB、LMK-235、MC1568、Oxamflatin、(-)-Parthenolide、PCI-34051、RG2833 (RGFP109)、RGFP966、Romidepsin (FK228, Depsipeptide)、Santacruzamate A (CAY10683)、Scriptaid、SKLB-23bb、Splitomicin、Suberoyl bis-hydroxamic acid、Tasquinimod、TH34、Tinostamustine(EDO-S101)、TMP195、TMP269、Tubacin及びTubastatin Aからなる群より選択される少なくとも１つである（１２）～（１４）のいずれかに記載の方法。
（１６）肝細胞が、多能性幹細胞から分化した細胞、多能性幹細胞から分化した細胞を継代培養した細胞、生体組織から単離された初代培養細胞、生体組織から単離された初代培養細胞を継代培養した細胞又はそれらの組み合わせである（１１）～（１５）のいずれかに記載の方法。
（１７）肝細胞がヒト由来である（１１）～（１６）のいずれかに記載の方法。
（１８）（１１）～（１７）のいずれかに記載の方法により作製され、増殖能と肝細胞・胆管上皮細胞への二方向の分化能を持つ、アルファフェトプロテイン（AFP）陰性の肝前駆細胞。
（１９）肝細胞及び／又は胆管細胞への分化が可能である（１８）記載の肝前駆細胞。
（２０）（１８）又は（１９）記載の肝前駆細胞を肝細胞に分化誘導することを含む、肝細胞の作製方法。
（２１）（１８）又は（１９）記載の肝前駆細胞を胆管細胞に分化誘導することを含む、胆管細胞の作製方法。
（２２）ヒストン高アセチル化をもたらす薬剤により、肝細胞の老化を抑制する方法。
（２３）ヒストン高アセチル化をもたらす薬剤をFGFファミリーのメンバーと組み合わせて用いる、（２２）記載の方法。
（２４）ヒストン高アセチル化をもたらす薬剤を有効成分として含む、肝細胞の老化抑制剤。
（２５）ヒストン高アセチル化をもたらす薬剤がヒストン脱アセチル化酵素阻害剤である（２４）記載の剤。
（２６）ヒストン脱アセチル化酵素阻害剤が、Trichostatin A、Tacedinaline (CI-994)、M344、ITSA-1、Sodium valproate、Sodium 4-phenylbutuyrate、Sodium Butyrate (NaB)、valproic acid (VPA)、Abexinostat (PCI-24781)、Belinostat(PXD101)、Citarinostat (ACY-241)、Dacinostat (LAQ824)、Depudecin、Domatinostat (4SC-202)、Droxinostat、Entinostat (MS-275, SNDX-275)、Fimepinostat (CUDC-907)、Givinostat (ITF2357)、Mocetinostat (MGCD0103)、Nexturastat A、Panobinostat (LBH-589,NVP-LBH589)、Pracinostat (SB939)、Quisinostat (JNJ-26481585) 2HCl、Resminostat、Ricolinostat (ACY-1215)、Tucidinostat (Chidamide)、Vorinostat (SAHA)、ACY-738、Apicidin、AR-42、BG45、BML-210、BRD73954、CAY10603、CUDC-101、Curcumin、Depudecin、H1388、HC Toxin、HPOB、LMK-235、MC1568、Oxamflatin、(-)-Parthenolide、PCI-34051、RG2833 (RGFP109)、RGFP966、Romidepsin (FK228, Depsipeptide)、Santacruzamate A (CAY10683)、Scriptaid、SKLB-23bb、Splitomicin、Suberoyl bis-hydroxamic acid、Tasquinimod、TH34、Tinostamustine(EDO-S101)、TMP195、TMP269、Tubacin及びTubastatin Aからなる群より選択される少なくとも１つである（２５）記載の剤。
（２７）ヒストン高アセチル化をもたらす薬剤がFGFファミリーのメンバーと組み合わせて用いられる、（２４）～（２６）のいずれかに記載の剤。
（２８）ヒストン高アセチル化をもたらす薬剤により、肝細胞の可塑性を増大させる方法。
（２９）ヒストン高アセチル化をもたらす薬剤をFGFファミリーのメンバーと組み合わせて用いる、（２８）記載の方法。
（３０）ヒストン高アセチル化をもたらす薬剤を有効成分として含む、肝細胞の可塑性を増大させる剤。
（３１）ヒストン高アセチル化をもたらす薬剤がヒストン脱アセチル化酵素阻害剤である（３０）記載の剤。
（３２）ヒストン脱アセチル化酵素阻害剤が、Trichostatin A、Tacedinaline (CI-994)、M344、ITSA-1、Sodium valproate、Sodium 4-phenylbutuyrate、Sodium Butyrate (NaB)、valproic acid (VPA)、Abexinostat (PCI-24781)、Belinostat(PXD101)、Citarinostat (ACY-241)、Dacinostat (LAQ824)、Depudecin、Domatinostat (4SC-202)、Droxinostat、Entinostat (MS-275, SNDX-275)、Fimepinostat (CUDC-907)、Givinostat (ITF2357)、Mocetinostat (MGCD0103)、Nexturastat A、Panobinostat (LBH-589,NVP-LBH589)、Pracinostat (SB939)、Quisinostat (JNJ-26481585) 2HCl、Resminostat、Ricolinostat (ACY-1215)、Tucidinostat (Chidamide)、Vorinostat (SAHA)、ACY-738、Apicidin、AR-42、BG45、BML-210、BRD73954、CAY10603、CUDC-101、Curcumin、Depudecin、H1388、HC Toxin、HPOB、LMK-235、MC1568、Oxamflatin、(-)-Parthenolide、PCI-34051、RG2833 (RGFP109)、RGFP966、Romidepsin (FK228, Depsipeptide)、Santacruzamate A (CAY10683)、Scriptaid、SKLB-23bb、Splitomicin、Suberoyl bis-hydroxamic acid、Tasquinimod、TH34、Tinostamustine(EDO-S101)、TMP195、TMP269、Tubacin及びTubastatin Aからなる群より選択される少なくとも１つである（３１）記載の剤。
（３３）ヒストン高アセチル化をもたらす薬剤がFGFファミリーのメンバーと組み合わせて用いられる、（３０）～（３２）のいずれかに記載の剤。
（３４）（６）記載の肝細胞、（１８）記載の肝前駆細胞及び（１８）記載の肝前駆細胞から分化誘導された細胞からなる群より選択される少なくとも１つの細胞を非ヒト動物に移植することを含む、キメラ動物の作製方法。
（３５）（６）記載の肝細胞、（１８）記載の肝前駆細胞及び（１８）記載の肝前駆細胞から分化誘導された細胞からなる群より選択される少なくとも１つの細胞を肝不全の非ヒト動物に移植することを含む、（３４）記載のキメラ動物の作製方法。
（３６）移植された肝前駆細胞が増殖及び/又は分化する、（３４）又は（３５）記載のキメラ動物の作製方法。
（３７）肝再生が促進する、（３４）～（３６）のいずれかに記載のキメラ動物の作製方法。
（３８）（６）記載の肝細胞、（１８）記載の肝前駆細胞及び（１８）記載の肝前駆細胞から分化誘導された細胞からなる群より選択される少なくとも１つの細胞を含む、移植用組成物。
（３９）（１８）又は（１９）記載の肝前駆細胞を胆管細胞に分化誘導するために使用される培地に使用するための、FGF10、レチノイン酸およびフォルスコリンを含有する剤；および該剤を該分化誘導に使用される培地に使用することの説明書；を含む、該分化誘導における培地用キット。
（４０）（１８）又は（１９）記載の肝前駆細胞を胆管細胞に分化誘導するための、FGF10、レチノイン酸およびフォルスコリンを含有する培地。
（４１）ヒストン高アセチル化をもたらす薬剤を有効成分として含む、肝再生促進剤。
（４２）ヒストン高アセチル化をもたらす薬剤を医薬的に有効な量で被験者に投与することを含む、肝再生を促進する方法。
【発明の効果】
（【００１１】以降は省略されています）

関連特許