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公開番号2025102402
公報種別公開特許公報(A)
公開日2025-07-08
出願番号2023219831
出願日2023-12-26
発明の名称5’非翻訳領域の改変方法
出願人花王株式会社
代理人弁理士法人アルガ特許事務所
主分類C12N 15/113 20100101AFI20250701BHJP(生化学;ビール;酒精;ぶどう酒;酢;微生物学;酵素学;突然変異または遺伝子工学)
要約【課題】微生物による目的物質生産における生産性の向上。
【解決手段】
改変プロモーターを含むDNA分子であって、該改変プロモーターは、リボソーム結合部位が置換又は挿入されており、該リボソーム結合部位は、該改変プロモーターの転写開始点から10～100ヌクレオチド下流に位置する、DNA分子。
【選択図】なし
特許請求の範囲【請求項１】
改変プロモーターを含むＤＮＡ分子であって、
該改変プロモーターは、リボソーム結合部位が置換又は挿入されており、
該リボソーム結合部位は、該改変プロモーターの転写開始点から１０～１００ヌクレオチド下流に位置する、
ＤＮＡ分子。
続きを表示（約 760 文字）【請求項２】
前記リボソーム結合部位が配列番号１又は配列番号２のヌクレオチド配列を含む、請求項１記載のＤＮＡ分子。
【請求項３】
前記改変プロモーターは、５’ＵＴＲに前記リボソーム結合部位を置換又は挿入されたバチルス属菌セルラーゼ遺伝子由来のプロモーターである、請求項１又は２記載のＤＮＡ分子。
【請求項４】
前記リボソーム結合部位を置換又は挿入される前のバチルス属菌セルラーゼ遺伝子由来のプロモーターが、配列番号５４又は５５のヌクレオチド配列又は当該配列と少なくとも８０％の同一性を有するヌクレオチド配列からなる、請求項３記載のＤＮＡ分子。
【請求項５】
前記改変プロモーターは、５’ＵＴＲに、１つ以上の別のリボソーム結合部位がさらに置換又は挿入されている、請求項１～４のいずれか１項記載のＤＮＡ分子。
【請求項６】
前記１つ以上の別のリボソーム結合部位が、各々、配列番号１又は配列番号２のヌクレオチド配列を含む、請求項５記載のＤＮＡ分子。
【請求項７】
前記１つ以上の別のリボソーム結合部位は、前記改変プロモーターの転写開始点から１０～１５０ヌクレオチド下流に位置する、請求項５又は６記載のＤＮＡ分子。
【請求項８】
前記改変プロモーターが本来のリボソーム結合部位を含む、請求項１～７のいずれか１項記載のＤＮＡ分子。
【請求項９】
目的物質又はその合成に関わる酵素をコードするポリヌクレオチドをさらに含む、請求項１～８のいずれか１項記載のＤＮＡ分子。
【請求項１０】
発現カセット又は発現ベクターである、請求項９記載のＤＮＡ分子。
（【請求項１１】以降は省略されています）
発明の詳細な説明【技術分野】
【０００１】
本発明は、５’非翻訳領域の改変方法、改変した５’非翻訳領域又はそれを含むプロモーターを含有するＤＮＡ分子、及びそれらを用いた目的物質の製造方法に関する。
続きを表示（約 2,300 文字）【背景技術】
【０００２】
微生物による物質の工業生産において、生産性の向上は重要な課題である。目的遺伝子の発現向上のための、プロモーター等の発現制御領域の改変に関する数多くの研究が以前より行なわれている。
【０００３】
特許文献１には、バチルス・エスピー（Ｂａｃｉｌｌｕｓｓｐ．）ＫＳＭ－Ｓ２３７株（ＦＥＲＭＢＰ－７８７５）及びＫＳＭ－６４株（ＦＥＲＭＢＰ－２８８６）のアルカリセルラーゼ遺伝子由来の、ｃａｔａｂｏｌｉｔｅｒｅｓｐｏｎｓｉｖｅｅｌｅｍｅｎｔ（ｃｒｅ）様配列を変異させた改変プロモーターが、目的遺伝子の発現を向上させることが記載されている。特許文献２には、ＫＳＭ－６４株のアルカリセルラーゼ遺伝子プロモーター領域のヌクレオチド配列の３２６位から３３０位の間に塩基挿入した改変プロモーターが目的遺伝子の発現を向上させることが記載されている。特許文献３、４には、枯草菌（Ｂａｃｉｌｌｕｓｓｕｂｔｉｌｉｓ）ａｐｒＥ遺伝子から得られる５’非翻訳領域（５’ＵＴＲ）配列を異種遺伝子と作動可能に連結して、該遺伝子の発現を向上させることが記載されている。特許文献５には目的遺伝子のプロモーター領域の下流かつリボソーム結合部位の上流に、Ｓｈｉｎｅ－Ｄａｌｇａｒｎｏ配列を追加した改変ｍＲＮＡプロセシング／安定化配列（mRNA processing/stabilizing sequence）を連結し、該目的遺伝子の発現を向上させることが記載されている。特許文献６には、ステムループを形成する特定のＤＮＡ配列を、目的物質の合成に関する遺伝子の転写開始部位より７ヌクレオチド以上下流に導入することによって、該目的物質の産生を増大する方法が記載されている。非特許文献１には、枯草菌においてsacBのリプレッサー遺伝子sacRの５’ＵＴＲにＳｈｉｎｅ－Ｄａｌｇａｒｎｏ様配列を導入することで、sacBの発現を制御したこと、導入数及び導入位置により発現が増加または減少したことが記載されている。非特許文献２には、バチルス属において目的遺伝子の５’ＵＴＲ領域にリボソーム結合部位と開始コドンを含む配列を複数個導入することにより、目的遺伝子の発現が向上したことが記載されている。
【先行技術文献】
【特許文献】
【０００４】
特開２０１１－１０３８７５号公報
特開２０００－０７８９８１号公報
特表２０１８－５０５６８６号公報
特表２０２０－５３４８２１号公報
国際公開公報第２００８／１４０６１５号
特表２００９－５１８０１９号公報
【非特許文献】
【０００５】
Lett Appl Microbiol, 2005, 41(2):221-6
Nucleic Acids Research, 2022, 50(20):11979-11990
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００６】
微生物による目的物質生産における生産性の向上が望まれる。本発明は、遺伝子の発現促進をもたらす５’ＵＴＲの改変方法、該方法で作製した改変５’ＵＴＲ又はそれを含むプロモーターを含有するＤＮＡ分子、及び該ＤＮＡ分子を用いた目的物質の製造方法に関する。
【課題を解決するための手段】
【０００７】
本発明者らは、微生物中の目的遺伝子のプロモーターに含まれる５’ＵＴＲの特定の位置に、追加のリボソーム結合部位（ＲＢＳ）を置換又は挿入することで、当該目的遺伝子の発現が顕著に促進されることを見出した。
【０００８】
したがって、一実施形態において、本発明は、改変プロモーターを含むＤＮＡ分子であって、
該改変プロモーターは、リボソーム結合部位が置換又は挿入されており、
該リボソーム結合部位は、該改変プロモーターの転写開始点から１０～１００ヌクレオチド下流に位置する、
ＤＮＡ分子、
を提供する。
別の一実施形態において、本発明は前記ＤＮＡ分子を含有する形質転換体を提供する。
さらに別の一実施形態において、本発明は、前記形質転換体を培養することを含む、目的物質の製造方法を提供する。
さらに別の一実施形態において、本発明は、改変プロモーターの製造方法であって、
該方法は、親プロモーターに含まれる５’ＵＴＲを改変することを含み、
該５’ＵＴＲの改変は、該５’ＵＴＲにリボソーム結合部位を置換又は挿入することを含み、
該リボソーム結合部位は、該改変プロモーターの転写開始点から１０～１００ヌクレオチド下流に位置し、
該親プロモーターは、リボソーム結合部位を置換又は挿入されていない５’ＵＴＲを含むプロモーターである、
方法、
を提供する。
【発明の効果】
【０００９】
本発明により、微生物による目的物質の生産性を顕著に向上させることができる。
【図面の簡単な説明】
【００１０】
実施例１で構築した追加ＲＢＳを含む改変プロモーター。黒色バーは追加ＲＢＳを表し、ドットバーは本来のＲＢＳを表す。
ｐｒｓＡ過剰発現株の作製方法。
追加ＲＢＳを含む改変プロモーターによるプロテアーゼ生産性向上。
改変プロモーターへのＲＢＳ挿入位置によるプロテアーゼ生産性への影響。
【発明を実施するための形態】
（【００１１】以降は省略されています）

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