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公開番号2025072214
公報種別公開特許公報(A)
公開日2025-05-09
出願番号2023182815
出願日2023-10-24
発明の名称形質転換体及びそれを用いるレゾルシンの製造方法
出願人公益財団法人地球環境産業技術研究機構,住友化学株式会社
代理人弁理士法人池内アンドパートナーズ
主分類C12N 1/21 20060101AFI20250430BHJP(生化学;ビール;酒精;ぶどう酒;酢;微生物学;酵素学;突然変異または遺伝子工学)
要約【課題】糖類を原料としてレゾルシンを生物学的に生産可能な形質転換体を提供する。
【解決手段】一態様において、微生物宿主に、サリチル酸を水酸化して2,4-ジヒドロキシ安息香酸を生成する活性を有する酵素をコードする遺伝子(A)及び2,4-ジヒドロキシ安息香酸脱炭酸活性を有する酵素をコードする遺伝子(B)が発現可能に導入されて得られる形質転換体に関する。その他の態様において、微生物宿主に、シトクロムP450をコードするcyp遺伝子と、シトクロムP450レダクターゼをコードするcpr遺伝子と、脱炭酸酵素をコードするptaG遺伝子、graF遺伝子、sdc遺伝子及びubiD遺伝子からなる群から選択される少なくとも一つとが、発現可能に導入されて得られる形質転換体に関する。
【選択図】図1
特許請求の範囲【請求項１】
微生物宿主に、下記遺伝子（Ａ）及び（Ｂ）が発現可能に導入されて得られる、形質転換体。
（Ａ）サリチル酸を水酸化して２，４－ジヒドロキシ安息香酸を生成する活性を有する酵素をコードする遺伝子。
（Ｂ）２，４－ジヒドロキシ安息香酸脱炭酸活性を有する酵素をコードする遺伝子。
続きを表示（約 2,400 文字）【請求項２】
前記遺伝子（Ａ）は、Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ属、Ｕｓｔｉｌａｇｏ属、Ｐｈａｎｅｒｏｃｈａｅｔｅ属、Ｃｏｃｈｌｉｏｂｏｌｕｓ属、Ｎｅｕｒｏｓｐｏｒａ属、及びＲｈｏｄｏｔｏｒｕｌａ属からなる群から選択される少なくとも一つの由来である、請求項１に記載の形質転換体。
【請求項３】
前記遺伝子（Ａ）は、少なくとも、下記の（Ａ１）、（Ａ２）及び（Ａ３）からなる群から選択される遺伝子を含む、請求項１に記載の形質転換体。
（Ａ１）配列番号６９、配列番号７０、配列番号７１、配列番号７２、配列番号７３又は配列番号７４で示されるアミノ酸配列を有するポリペプチドをコードする遺伝子；
（Ａ２）配列番号６９、配列番号７０、配列番号７１、配列番号７２、配列番号７３又は配列番号７４で示されるアミノ酸配列と８５％以上の同一性を有するアミノ酸配列を有するポリペプチドをコードする遺伝子であって、サリチル酸を水酸化して２，４－ジヒドロキシ安息香酸を生成する活性を有するポリペプチドをコードする遺伝子；
（Ａ３）配列番号６９、配列番号７０、配列番号７１、配列番号７２、配列番号７３又は配列番号７４で示されるアミノ酸配列を有するポリペプチドをコードする遺伝子と相補的な塩基配列を有する遺伝子と、ストリンジェントな条件下でハイブリダイズする遺伝子であって、サリチル酸を水酸化して２，４－ジヒドロキシ安息香酸を生成する活性を有するポリペプチドをコードする遺伝子。
【請求項４】
前記遺伝子（Ａ）は、少なくとも、下記の（Ａ４）、（Ａ５）及び（Ａ６）からなる群から選択される遺伝子を含む、請求項１に記載の形質転換体。
（Ａ４）配列番号１、配列番号４、配列番号７、配列番号１０、配列番号１３又は配列番号１６で示される塩基配列を有する遺伝子；
（Ａ５）配列番号１、配列番号４、配列番号７、配列番号１０、配列番号１３又は配列番号１６で示される塩基配列と８５％以上の同一性を有する塩基配列を有する遺伝子であって、サリチル酸を水酸化して２，４－ジヒドロキシ安息香酸を生成する活性を有するポリペプチドをコードする遺伝子；
（Ａ６）配列番号１、配列番号４、配列番号７、配列番号１０、配列番号１３又は配列番号１６で示される塩基配列を有する遺伝子と相補的な塩基配列を有する遺伝子と、ストリンジェントな条件下でハイブリダイズする遺伝子であって、サリチル酸を水酸化して２，４－ジヒドロキシ安息香酸を生成する活性を有するポリペプチドをコードする遺伝子。
【請求項５】
前記遺伝子（Ｂ）は、Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ属、Ｔｓｕｋａｍｕｒｅｌｌａ属、Ｍｙｃｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ属、Ｃｕｔａｎｅｏｔｒｉｃｈｏｓｐｏｒｏｎ属、Ｐａｎｔｏｅａ属、及びＥｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ属からなる群から選択される少なくとも一つの由来である、請求項１に記載の形質転換体。
【請求項６】
前記遺伝子（Ｂ）は、少なくとも、下記の（Ｂ１）、（Ｂ２）及び（Ｂ３）からなる群から選択される遺伝子を含む、請求項１に記載の形質転換体。
（Ｂ１）配列番号８３、配列番号８４、配列番号８５、配列番号８６、配列番号８７又は配列番号８８で示されるアミノ酸配列を有するポリペプチドをコードする遺伝子；
（Ｂ２）配列番号８３、配列番号８４、配列番号８５、配列番号８６、配列番号８７又は配列番号８８で示されるアミノ酸配列と８５％以上の同一性を有するアミノ酸配列を有するポリペプチドをコードする遺伝子であって、２，４－ジヒドロキシ安息香酸脱炭酸活性を有するポリペプチドをコードする遺伝子；
（Ｂ３）配列番号８３、配列番号８４、配列番号８５、配列番号８６、配列番号８７又は配列番号８８で示されるアミノ酸配列を有するポリペプチドをコードする遺伝子と相補的な塩基配列を有する遺伝子と、ストリンジェントな条件下でハイブリダイズする遺伝子であって、２，４－ジヒドロキシ安息香酸脱炭酸活性を有するポリペプチドをコードする遺伝子。
【請求項７】
前記遺伝子（Ｂ）は、少なくとも、下記の（Ｂ４）、（Ｂ５）及び（Ｂ６）からなる群から選択される遺伝子を含む、請求項１に記載の形質転換体。
（Ｂ４）配列番号４３、配列番号４６、配列番号４９、配列番号５２、配列番号９０又は配列番号９１で示される塩基配列を有する遺伝子；
（Ｂ５）配列番号４３、配列番号４６、配列番号４９、配列番号５２、配列番号９０又は配列番号９１で示される塩基配列と８５％以上の同一性を有する塩基配列を有する遺伝子であって、２，４－ジヒドロキシ安息香酸脱炭酸活性を有するポリペプチドをコードする遺伝子；
（Ｂ６）配列番号４３、配列番号４６、配列番号４９、配列番号５２、配列番号９０又は配列番号９１で示される塩基配列を有する遺伝子と相補的な塩基配列を有する遺伝子と、ストリンジェントな条件下でハイブリダイズする遺伝子であって、２，４－ジヒドロキシ安息香酸脱炭酸活性を有するポリペプチドをコードする遺伝子。
【請求項８】
前記遺伝子（Ｂ）は、サリチル酸に対する脱炭酸酵素活性を実質的に有さない脱炭酸酵素をコードするか、又は２，４－ジヒドロキシ安息香酸に対する脱炭酸酵素活性がサリチル酸に対する脱炭酸酵素活性よりも高い脱炭酸酵素をコードする、請求項１に記載の形質転換体。
【請求項９】
前記微生物宿主は、コリネ型細菌である、請求項１に記載の形質転換体。
【請求項１０】
前記微生物宿主は、コリネバクテリウムグルタミカムである、請求項１に記載の形質転換体。
（【請求項１１】以降は省略されています）
発明の詳細な説明【技術分野】
【０００１】
レゾルシン（ＣＡＳ番号：１０８－４６－３。レゾルシノール、１，３－ジヒドロキシベンゼンなども同義）は、ゴム、自動車、化学、及び建設などの各種業界で幅広い用途があり、例えば、ゴム・タイヤ用接着剤、木製品用接着剤、難燃剤、紫外線吸収剤、ポリカーボネート、農薬、ウレタンエラストマー及び染料など、多くの化学品に必要な原料とされている。
続きを表示（約 1,500 文字）【０００２】
従来、レゾルシンは、石油由来の原料（ｍ－ジイソプロピルベンゼン及びベンゼンメタジスルホン酸など）から化学的に生産されてきた。近年、二酸化炭素の排出量の低減などのため、石油由来の原料から、非可食バイオマス由来の原料などの再生可能な原料を用いて、レゾルシンが製造されることなどが要望されている。
【０００３】
ところで、糖原料などからコリスミ酸を経てサリチル酸を生産する技術については、例えば、以下に示すような文献等に開示されている。特許文献１には、「糖代謝経路が改変された微生物の製造方法」において、「該微生物がコリスミ酸又はイソコリスミ酸から芳香族化合物を合成することを可能とする酵素をコードする１若しくは複数の遺伝子を微生物に導入する」技術、ないし「芳香族化合物がサリチル酸であり、イソコリスミ酸シンターゼをコードする遺伝子及びイソコリスミ酸ピルビン酸リアーゼをコードする遺伝子を導入する」技術等が開示されている。特許文献２には、「ＭｅｎＦのカルボキシ末端にＰｃｈＢが結合した融合タンパク質を外来的に発現させることによって、・・・サリチル酸生産性を・・・向上できる」技術（いわゆる、２機能酵素に係る技術）等が開示されている。非特許文献１には、「Amycolatopsis methanolica」由来の「salicylate synthase」を用いて、コリスミ酸からサリチル酸を生産する技術等が開示されている。
【先行技術文献】
【特許文献】
【０００４】
国際公開第２０１７／０３３９６５号（請求項１、３、図７等）
特開２０１６－８６６８８号公報（要約書等）
【非特許文献】
【０００５】
ＡｐｐｌＭｉｃｒｏｂｉｏｌＢｉｏｔｅｃｈｎｏｌ９９（１４）：５８９５－９０５（２０１５）．
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００６】
本開示は、糖類などを原料としてレゾルシンを生物学的に製造できる形質転換体、及び、当該形質転換体を用いてレゾルシンを製造する方法を提供する。
【課題を解決するための手段】
【０００７】
本開示は、一態様において、微生物宿主に、サリチル酸を水酸化して２，４－ジヒドロキシ安息香酸を生成する活性を有する酵素をコードする遺伝子（Ａ）及び２，４－ジヒドロキシ安息香酸脱炭酸活性を有する酵素をコードする遺伝子（Ｂ）が発現可能に導入されて得られる形質転換体に関する。
【０００８】
本開示は、その他の一態様において、微生物宿主に、シトクロムＰ４５０をコードするcyp遺伝子と、シトクロムＰ４５０レダクターゼをコードするcpr遺伝子と、脱炭酸酵素をコードするptaG遺伝子、graF遺伝子、sdc遺伝子及びubiD遺伝子からなる群から選択される少なくとも一つとが、発現可能に導入されて得られる形質転換体に関する。
【０００９】
本開示は、その他の一態様において、本開示の形質転換体を糖類の存在下で培養してレゾルシンを生産させる工程を含む、レゾルシンの製造方法に関する。
【発明の効果】
【００１０】
本開示によれば、一態様において、糖類などを原料としてレゾルシンを生産できる形質転換体を提供できる。本開示によれば、その他の一態様において、この形質転換体を用いてレゾルシンを生物学的に製造（生産）できる。
【図面の簡単な説明】
（【００１１】以降は省略されています）

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