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公開番号2025041861
公報種別公開特許公報(A)
公開日2025-03-26
出願番号2024228449,2021010565
出願日2024-12-25,2021-01-26
発明の名称リガーゼ変異体
出願人味の素株式会社
代理人弁理士法人酒井国際特許事務所
主分類C12N 9/88 20060101AFI20250318BHJP(生化学;ビール;酒精;ぶどう酒;酢;微生物学;酵素学;突然変異または遺伝子工学)
要約【課題】優れた性質を有するリガーゼ変異体を提供すること。
【解決手段】下記(1)、(2)または(3)のリガーゼ変異体:
(1)配列番号1のアミノ酸配列に対して95%以上の同一性を示すアミノ酸配列を含み、かつ、核酸の連結活性を有するリガーゼ変異体;
(2)配列番号2のアミノ酸配列に対して90%以上の同一性を示すアミノ酸配列を含み、かつ、核酸の連結活性を有するリガーゼ変異体;または
(3)配列番号3のアミノ酸配列に対して97%以上の同一性を示すアミノ酸配列を含み、かつ、核酸の連結活性を有するリガーゼ変異体。
【選択図】なし
特許請求の範囲【請求項１】
下記（１）、（２）または（３）のリガーゼ変異体：
（１）配列番号１のアミノ酸配列に対して９５％以上の同一性を示すアミノ酸配列を含み、かつ、核酸の連結活性を有するリガーゼ変異体；
（２）配列番号２のアミノ酸配列に対して９０％以上の同一性を示すアミノ酸配列を含み、かつ、核酸の連結活性を有するリガーゼ変異体；または
（３）配列番号３のアミノ酸配列に対して９７％以上の同一性を示すアミノ酸配列を含み、かつ、核酸の連結活性を有するリガーゼ変異体。
続きを表示（約 570 文字）【請求項２】
核酸が、ＤＮＡおよび／または修飾核酸を含んでいてもよい一本鎖ＲＮＡまたは二本鎖ＲＮＡである、請求項１記載のリガーゼ変異体。
【請求項３】
請求項１または２記載のリガーゼ変異体の存在下で核酸材料を連結して核酸生成物を生成することを含み、
核酸材料が、一本鎖核酸材料、二本鎖核酸材料、およびそれらの混合物からなる群より選ばれる、核酸生成物の製造方法。
【請求項４】
核酸材料がＲＮＡである、請求項３記載の方法。
【請求項５】
核酸材料が４本以上の一本鎖ＲＮＡである、請求項３または４記載の方法。
【請求項６】
核酸生成物が１２～２７塩基長の相補部分を含む、請求項３～５のいずれか一項記載の方法。
【請求項７】
核酸材料がＤＮＡおよび／または修飾核酸を含む、請求項３～６のいずれか一項記載の方法。
【請求項８】
核酸材料の濃度が１μＭ以上である、請求項３～７のいずれか一項記載の方法。
【請求項９】
核酸生成物がｓｉＲＮＡである、請求項３～８のいずれか一項記載の方法。
【請求項１０】
請求項１または２記載のリガーゼ変異体をコードするポリヌクレオチド。
（【請求項１１】以降は省略されています）
発明の詳細な説明【技術分野】
【０００１】
本発明は、リガーゼ変異体などに関する。
続きを表示（約 4,200 文字）【背景技術】
【０００２】
Ｔ４ＲＮＡリガーゼ２は、ＡＴＰの存在下でリボヌクレオチドの連結能を有するＲＮＡリガーゼ（ＥＣ６．５．１．３）の一種であり、エシェリヒアへの感染能を有するＴ４バクテリオファージに由来する酵素である（ＮＰ＿０４９７９０）。Ｔ４ＲＮＡリガーゼ２は、ホスホジエステル結合を形成することにより、核酸の５’末端のリン酸基（ドナー）を３’末端のヒドロキシル基（アクセプター）に連結する能力を有する。Ｔ４ＲＮＡリガーゼ２は、突出末端を有する二本鎖ＲＮＡの連結、および二本鎖ＲＮＡ中のニックの連結等の反応に使用されている。Ｔ４ＲＮＡリガーゼ２はまた、ＲＮＡのみならず、ＤＮＡ、ならびにＤＮＡおよびＲＮＡ以外の修飾核酸も基質として利用できることが知られている。また、Ｔ４ＲＮＡリガーゼ２には、幾つかの変異体が知られている。Ｔ４ＲＮＡリガーゼ２の先行技術については、下記を参照することができる。
【先行技術文献】
【特許文献】
【０００３】
国際公開第２００８／０９４５９９号
【非特許文献】
【０００４】
［ｏｎｌｉｎｅ］，ＩＮＴＥＲＮＥＴ，ＮＣＢＩＰｒｏｔｅｉｎＤａｔａｂａｓｅ，２０１８年８月１３日，ＮＰ＿０４９７９０，検索日：２０２０年２月２７日，ＵＲＬ，ｈｔｔｐｓ：／／ｗｗｗ．ｎｃｂｉ．ｎｌｍ．ｎｉｈ．ｇｏｖ／ｐｒｏｔｅｉｎ／ＮＰ＿０４９７９０
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Ｎａｎｄａｋｕｍａｒ，Ｊ．，Ｓｈｕｍａｎ，Ｓ．，Ｌｉｍａ，Ｃ．Ｄ．（２００６）．ＲＮＡｌｉｇａｓｅｓｔｒｕｃｔｕｒｅｓｒｅｖｅａｌｔｈｅｂａｓｉｓｆｏｒＲＮＡｓｐｅｃｉｆｉｃｉｔｙａｎｄｃｏｎｆｏｒｍａｔｉｏｎａｌｃｈａｎｇｅｓｔｈａｔｄｒｉｖｅｌｉｇａｔｉｏｎｆｏｒｗａｒｄ．Ｃｅｌｌ，６；１２７（１）：７１－８４．
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Ｎａｎｄａｋｕｍａｒ，Ｊ．，Ｈｏ，Ｃ．Ｋ．，Ｌｉｍａ，Ｃ．Ｄ．，Ｓｈｕｍａｎ，Ｓ．（２００４）．ＲＮＡｓｕｂｓｔｒａｔｅｓｐｅｃｉｆｉｃｉｔｙａｎｄｓｔｒｕｃｔｕｒｅ－ｇｕｉｄｅｄｍｕｔａｔｉｏｎａｌａｎａｌｙｓｉｓｏｆｂａｃｔｅｒｉｏｐｈａｇｅＴ４ＲＮＡｌｉｇａｓｅ２．Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．，２３；２７９（３０）：３１３３７－４７．
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【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００５】
本発明の目的は、優れた性質を有するリガーゼ変異体を提供することである。
【課題を解決するための手段】
【０００６】
本発明者らは、鋭意検討した結果、Ｔ４ＲＮＡリガーゼ２（ＮＰ＿０４９７９０）に対してそれぞれ９３％、８７％および９５％のアミノ酸配列同一性を示し（後述の表１を参照）、かつ当該Ｔ４ＲＮＡリガーゼ２に比し優れた性質を有する３種のリガーゼ変異体Ｍｕｔ１～３（配列番号１～３）を開発することに成功し、もって本発明を完成するに至った。上記先行技術は、このような３種のリガーゼ変異体を教示も示唆もしていない。
【０００７】
すなわち、本発明は、以下のとおりである。
〔１〕下記（１）、（２）または（３）のリガーゼ変異体：
（１）配列番号１のアミノ酸配列に対して９５％以上の同一性を示すアミノ酸配列を含み、かつ、核酸の連結活性を有するリガーゼ変異体；
（２）配列番号２のアミノ酸配列に対して９０％以上の同一性を示すアミノ酸配列を含み、かつ、核酸の連結活性を有するリガーゼ変異体；または
（３）配列番号３のアミノ酸配列に対して９７％以上の同一性を示すアミノ酸配列を含み、かつ、核酸の連結活性を有するリガーゼ変異体。
〔２〕核酸が、ＤＮＡおよび／または修飾核酸を含んでいてもよい一本鎖ＲＮＡまたは二本鎖ＲＮＡである、〔１〕のリガーゼ変異体。
〔３〕〔１〕または〔２〕のリガーゼ変異体の存在下で核酸材料を連結して核酸生成物を生成することを含み、
核酸材料が、一本鎖核酸材料、二本鎖核酸材料、およびそれらの混合物からなる群より選ばれる、核酸生成物の製造方法。
〔４〕核酸材料がＲＮＡである、〔３〕の方法。
〔５〕核酸材料が４本以上の一本鎖ＲＮＡである、〔３〕または〔４〕の方法。
〔６〕核酸生成物が１２～２７塩基長の相補部分を含む、〔３〕～〔５〕のいずれかの方法。
〔７〕核酸材料がＤＮＡおよび／または修飾核酸を含む、〔３〕～〔６〕のいずれかの方法。
〔８〕核酸材料の濃度が１μＭ以上である、〔３〕～〔７〕のいずれかの方法。
〔９〕核酸生成物がｓｉＲＮＡである、〔３〕～〔８〕のいずれかの方法。
〔１０〕〔１〕または〔２〕のリガーゼ変異体をコードするポリヌクレオチド。
〔１１〕〔１０〕のポリヌクレオチドを含む発現ベクター。
〔１２〕〔１〕または〔２〕のリガーゼ変異体をコードするポリヌクレオチド、およびそれに作動可能に連結されたプロモーターを含む発現単位を含む形質転換微生物。
〔１３〕〔１〕または〔２〕のリガーゼ変異体を、〔１２〕の形質転換微生物を用いて生成することを含む、リガーゼ変異体の製造方法。
【発明の効果】
【０００８】
本発明によれば、核酸材料から核酸生成物（例、ｓｉＲＮＡやヘテロ二本鎖核酸等の修飾核酸）を効率的に製造することができる。
【図面の簡単な説明】
【０００９】
図１は、本発明のリガーゼ変異体（Ｍｕｔ１～３）のアミノ酸配列（配列番号１～３）を示す図である。
図２は、４断片の一本鎖オリゴヌクレオチドのライゲーション反応により生成する二本鎖オリゴヌクレオチドを示す図である。修飾ヌクレオチド残基の表記は、表２のものと同じである。
図３は、（Ａ）４断片の一本鎖オリゴヌクレオチドのライゲーション反応により生成する二本鎖オリゴヌクレオチド、および（Ｂ）当該二本鎖オリゴヌクレオチドの生成のタイムコースを示す図である。修飾ヌクレオチド残基の表記は、表４のものと同じである。
図４は、（Ａ）３断片の一本鎖オリゴヌクレオチドのライゲーション反応により生成する二本鎖オリゴヌクレオチド、および（Ｂ）当該二本鎖オリゴヌクレオチドの量（反応時間１５分）を示す図である。ライゲーションポイントから－２位、－１位、＋１位、＋２位のヌクレオチド残基の２’位がフッ素原子（Ｆ）、Ｏ－メチル（Ｏｍｅ）、Ｏ－メトキシエチル（ＭＯＥ）に修飾された、または水素原子（ＤＮＡ）に置換されたオリゴヌクレオチドを基質として用いた。
【発明を実施するための形態】
【００１０】
１．リガーゼ変異体
本発明は、下記（１）、（２）または（３）のリガーゼ変異体を提供する：
（１）配列番号１のアミノ酸配列に対して９５％以上の同一性を示すアミノ酸配列を含み、かつ、核酸の連結活性を有するリガーゼ変異体；
（２）配列番号２のアミノ酸配列に対して９０％以上の同一性を示すアミノ酸配列を含み、かつ、核酸の連結活性を有するリガーゼ変異体；または
（３）配列番号３のアミノ酸配列に対して９７％以上の同一性を示すアミノ酸配列を含み、かつ、核酸の連結活性を有するリガーゼ変異体。
（【００１１】以降は省略されています）

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