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公開番号2025096189
公報種別公開特許公報(A)
公開日2025-06-26
出願番号2024211778
出願日2024-12-04
発明の名称リパーゼ変異体
出願人花王株式会社
代理人弁理士法人アルガ特許事務所
主分類C12N 9/20 20060101AFI20250619BHJP(生化学;ビール;酒精;ぶどう酒;酢;微生物学;酵素学;突然変異または遺伝子工学)
要約【課題】優れた安定性を示すリパーゼ変異体の提供。
【解決手段】配列番号4の番号付けでL16、G22、Y29、Y43、A45、T46、L50、S120、K123、R126、T134、L142、A145、G156、K174、A181、Q186、K188、L190、D191、L208、H209、M212、L215、V220、A221、L223、A224、F225、L228、R233、F234、S256、V260、L266、V269、N272、T274、K278及びR286位に相当する位置から選択される1箇所以上の位置でのアミノ酸残基の置換を含む、親リパーゼの変異体であって、前記親リパーゼ又は前記リパーゼ変異体が配列番号4又は6で示されるアミノ酸配列に対して少なくとも80%の配列同一性を有する、リパーゼ変異体。
【選択図】なし
特許請求の範囲【請求項１】
配列番号４の番号付けでＬ１６、Ｇ２２、Ｙ２９、Ｙ４３、Ａ４５、Ｔ４６、Ｌ５０、Ｓ１２０、Ｋ１２３、Ｒ１２６、Ｔ１３４、Ｌ１４２、Ａ１４５、Ｇ１５６、Ｋ１７４、Ａ１８１、Ｑ１８６、Ｋ１８８、Ｌ１９０、Ｄ１９１、Ｌ２０８、Ｈ２０９、Ｍ２１２、Ｌ２１５、Ｖ２２０、Ａ２２１、Ｌ２２３、Ａ２２４、Ｆ２２５、Ｌ２２８、Ｒ２３３、Ｆ２３４、Ｓ２５６、Ｖ２６０、Ｌ２６６、Ｖ２６９、Ｎ２７２、Ｔ２７４、Ｋ２７８及びＲ２８６位に相当する位置から選択される１箇所以上の位置でのアミノ酸残基の置換を含む、親リパーゼの変異体であって、前記親リパーゼ又は前記リパーゼ変異体が配列番号４又は６で示されるアミノ酸配列に対して少なくとも８０％の配列同一性を有する、リパーゼ変異体。
続きを表示（約 3,300 文字）【請求項２】
前記配列番号４の番号付けでＬ１６、Ｇ２２、Ｙ２９、Ｙ４３、Ａ４５、Ｔ４６、Ｌ５０、Ｓ１２０、Ｋ１２３、Ｒ１２６、Ｔ１３４、Ｌ１４２、Ａ１４５、Ｇ１５６、Ｋ１７４、Ａ１８１、Ｑ１８６、Ｋ１８８、Ｌ１９０、Ｄ１９１、Ｌ２０８、Ｈ２０９、Ｍ２１２、Ｌ２１５、Ｖ２２０、Ａ２２１、Ｌ２２３、Ａ２２４、Ｆ２２５、Ｌ２２８、Ｒ２３３、Ｆ２３４、Ｓ２５６、Ｖ２６０、Ｌ２６６、Ｖ２６９、Ｎ２７２、Ｔ２７４、Ｋ２７８及びＲ２８６の各位置に相当する位置のアミノ酸残基の置換が、それぞれ、Ｌ１６Ｆ、Ｇ２２Ｃ／Ｍ、Ｙ２９Ｆ、Ｙ４３Ｗ、Ａ４５Ｖ、Ｔ４６Ｑ、Ｌ５０Ｉ／Ｍ／Ｖ、Ｓ１２０Ａ／Ｑ、Ｋ１２３Ｉ／Ｔ、Ｒ１２６Ｅ、Ｔ１３４Ａ、Ｌ１４２Ｆ、Ａ１４５Ｃ／Ｑ、Ｇ１５６Ａ、Ｋ１７４Ｄ、Ａ１８１Ｋ、Ｑ１８６Ｅ、Ｋ１８８Ｑ、Ｌ１９０Ｆ、Ｄ１９１Ａ／Ｅ／Ｖ、Ｌ２０８Ｃ、Ｈ２０９Ｋ、Ｍ２１２Ｌ、Ｌ２１５Ｃ、Ｖ２２０Ｈ、Ａ２２１Ｈ、Ｌ２２３Ａ／Ｅ／Ｓ／Ｖ、Ａ２２４Ｆ／Ｑ／Ｙ、Ｆ２２５Ｔ、Ｌ２２８Ｗ、Ｒ２３３Ｋ／Ｑ／Ｔ、Ｆ２３４Ｗ、Ｓ２５６Ｎ、Ｖ２６０Ａ／Ｃ／Ｆ／Ｇ／Ｌ／Ｍ／Ｔ、Ｌ２６６Ｐ、Ｖ２６９Ｉ／Ｌ／Ｍ、Ｎ２７２Ｃ／Ｇ／Ｔ、Ｔ２７４Ｉ／Ｑ、Ｋ２７８Ａ及びＲ２８６Ｍである、請求項１記載のリパーゼ変異体。
【請求項３】
下記（Ａ）～（Ｄ）のいずれかの置換を少なくとも含む、請求項２記載のリパーゼ変異体。
（Ａ）配列番号４の番号付けでのＮ２７２Ｃ／Ｇ／Ｔの置換とＬ１６Ｆ、Ｇ２２Ｃ／Ｍ、Ｙ２９Ｆ、Ｙ４３Ｗ、Ａ４５Ｖ、Ｔ４６Ｑ、Ｌ５０Ｉ／Ｍ／Ｖ、Ｓ１２０Ａ／Ｑ、Ｋ１２３Ｉ／Ｔ、Ｒ１２６Ｅ、Ｔ１３４Ａ、Ｌ１４２Ｆ、Ａ１４５Ｃ／Ｑ、Ｇ１５６Ａ、Ｋ１７４Ｄ、Ａ１８１Ｋ、Ｑ１８６Ｅ、Ｋ１８８Ｑ、Ｌ１９０Ｆ、Ｄ１９１Ａ／Ｅ／Ｖ、Ｌ２０８Ｃ、Ｈ２０９Ｋ、Ｍ２１２Ｌ、Ｌ２１５Ｃ、Ｖ２２０Ｈ、Ａ２２１Ｈ、Ｌ２２３Ａ／Ｅ／Ｓ／Ｖ、Ａ２２４Ｆ／Ｑ／Ｙ、Ｆ２２５Ｔ、Ｌ２２８Ｗ、Ｒ２３３Ｋ／Ｑ／Ｔ、Ｆ２３４Ｗ、Ｓ２５６Ｎ、Ｖ２６０Ａ／Ｃ／Ｆ／Ｇ／Ｌ／Ｍ／Ｔ、Ｌ２６６Ｐ、Ｖ２６９Ｉ／Ｌ／Ｍ、Ｔ２７４Ｉ／Ｑ、Ｋ２７８Ａ及びＲ２８６Ｍから選択される１以上の置換
（Ｂ）配列番号４の番号付けでのＶ２２０Ｈの置換とＬ１６Ｆ、Ｇ２２Ｃ／Ｍ、Ｙ２９Ｆ、Ｙ４３Ｗ、Ａ４５Ｖ、Ｔ４６Ｑ、Ｌ５０Ｉ／Ｍ／Ｖ、Ｓ１２０Ａ／Ｑ、Ｋ１２３Ｉ／Ｔ、Ｒ１２６Ｅ、Ｔ１３４Ａ、Ｌ１４２Ｆ、Ａ１４５Ｃ／Ｑ、Ｇ１５６Ａ、Ｋ１７４Ｄ、Ａ１８１Ｋ、Ｑ１８６Ｅ、Ｋ１８８Ｑ、Ｌ１９０Ｆ、Ｄ１９１Ａ／Ｅ／Ｖ、Ｌ２０８Ｃ、Ｈ２０９Ｋ、Ｍ２１２Ｌ、Ｌ２１５Ｃ、Ａ２２１Ｈ、Ｌ２２３Ａ／Ｅ／Ｓ／Ｖ、Ａ２２４Ｆ／Ｑ／Ｙ、Ｆ２２５Ｔ、Ｌ２２８Ｗ、Ｒ２３３Ｋ／Ｑ／Ｔ、Ｆ２３４Ｗ、Ｓ２５６Ｎ、Ｖ２６０Ａ／Ｃ／Ｆ／Ｇ／Ｌ／Ｍ／Ｔ、Ｌ２６６Ｐ、Ｖ２６９Ｉ／Ｌ／Ｍ、Ｎ２７２Ｃ／Ｇ／Ｔ、Ｔ２７４Ｉ／Ｑ、Ｋ２７８Ａ及びＲ２８６Ｍから選択される１以上の置換
（Ｃ）配列番号４の番号付けでのＶ２６０Ａ／Ｃ／Ｆ／Ｇ／Ｌ／Ｍ／Ｔの置換とＬ１６Ｆ、Ｇ２２Ｃ／Ｍ、Ｙ２９Ｆ、Ｙ４３Ｗ、Ａ４５Ｖ、Ｔ４６Ｑ、Ｌ５０Ｉ／Ｍ／Ｖ、Ｓ１２０Ａ／Ｑ、Ｋ１２３Ｉ／Ｔ、Ｒ１２６Ｅ、Ｔ１３４Ａ、Ｌ１４２Ｆ、Ａ１４５Ｃ／Ｑ、Ｇ１５６Ａ、Ｋ１７４Ｄ、Ａ１８１Ｋ、Ｑ１８６Ｅ、Ｋ１８８Ｑ、Ｌ１９０Ｆ、Ｄ１９１Ａ／Ｅ／Ｖ、Ｌ２０８Ｃ、Ｈ２０９Ｋ、Ｍ２１２Ｌ、Ｌ２１５Ｃ、Ｖ２２０Ｈ、Ａ２２１Ｈ、Ｌ２２３Ａ／Ｅ／Ｓ／Ｖ、Ａ２２４Ｆ／Ｑ／Ｙ、Ｆ２２５Ｔ、Ｌ２２８Ｗ、Ｒ２３３Ｋ／Ｑ／Ｔ、Ｆ２３４Ｗ、Ｓ２５６Ｎ、Ｌ２６６Ｐ、Ｖ２６９Ｉ／Ｌ／Ｍ、Ｎ２７２Ｃ／Ｇ／Ｔ、Ｔ２７４Ｉ／Ｑ、Ｋ２７８Ａ及びＲ２８６Ｍから選択される１以上の置換
（Ｄ）配列番号４の番号付けでのＬ２０８Ｃの置換とＬ１６Ｆ、Ｇ２２Ｃ／Ｍ、Ｙ２９Ｆ、Ｙ４３Ｗ、Ａ４５Ｖ、Ｔ４６Ｑ、Ｌ５０Ｉ／Ｍ／Ｖ、Ｓ１２０Ａ／Ｑ、Ｋ１２３Ｉ／Ｔ、Ｒ１２６Ｅ、Ｔ１３４Ａ、Ｌ１４２Ｆ、Ａ１４５Ｃ／Ｑ、Ｇ１５６Ａ、Ｋ１７４Ｄ、Ａ１８１Ｋ、Ｑ１８６Ｅ、Ｋ１８８Ｑ、Ｌ１９０Ｆ、Ｄ１９１Ａ／Ｅ／Ｖ、Ｈ２０９Ｋ、Ｍ２１２Ｌ、Ｌ２１５Ｃ、Ｖ２２０Ｈ、Ａ２２１Ｈ、Ｌ２２３Ａ／Ｅ／Ｓ／Ｖ、Ａ２２４Ｆ／Ｑ／Ｙ、Ｆ２２５Ｔ、Ｌ２２８Ｗ、Ｒ２３３Ｋ／Ｑ／Ｔ、Ｆ２３４Ｗ、Ｓ２５６Ｎ、Ｖ２６０Ａ／Ｃ／Ｆ／Ｇ／Ｌ／Ｍ／Ｔ、Ｌ２６６Ｐ、Ｖ２６９Ｉ／Ｌ／Ｍ、Ｎ２７２Ｃ／Ｇ／Ｔ、Ｔ２７４Ｉ／Ｑ、Ｋ２７８Ａ及びＲ２８６Ｍから選択される１以上の置換
【請求項４】
下記（Ａ’）～（Ｄ’）のいずれかの置換を少なくとも含む、請求項２記載のリパーゼ変異体。
（Ａ’）配列番号４の番号付けでのＮ２７２Ｃ／Ｇの置換とＬ１６Ｆ、Ｇ２２Ｍ、Ｙ２９Ｆ、Ｙ４３Ｗ、Ｌ５０Ｉ／Ｖ、Ｓ１２０Ａ／Ｑ、Ｋ１２３Ｉ／Ｔ、Ｒ１２６Ｅ、Ｌ１４２Ｆ、Ｇ１５６Ａ、Ａ１８１Ｋ、Ｑ１８６Ｅ、Ｋ１８８Ｑ、Ｌ１９０Ｆ、Ｄ１９１Ｖ、Ｌ２０８Ｃ、Ｍ２１２Ｌ、Ｖ２２０Ｈ、Ａ２２１Ｈ、Ｌ２２３Ｖ、Ａ２２４Ｑ、Ｆ２２５Ｔ、Ｌ２２８Ｗ、Ｒ２３３Ｋ／Ｔ、Ｆ２３４Ｗ、Ｓ２５６Ｎ、Ｖ２６０Ａ／Ｃ／Ｌ、Ｖ２６９Ｉ／Ｌ、Ｔ２７４Ｑ及びＫ２７８Ａから選択される１以上の置換
（Ｂ’）配列番号４の番号付けでのＶ２２０Ｈの置換とＬ１６Ｆ、Ｇ２２Ｃ／Ｍ、Ｙ４３Ｗ、Ｌ５０Ｉ／Ｖ、Ｓ１２０Ｑ、Ｋ１２３Ｉ／Ｔ、Ｒ１２６Ｅ、Ｌ１４２Ｆ、Ｇ１５６Ａ、Ａ１８１Ｋ、Ｑ１８６Ｅ、Ｋ１８８Ｑ、Ｌ１９０Ｆ、Ｄ１９１Ａ／Ｅ／Ｖ、Ｌ２０８Ｃ、Ｍ２１２Ｌ、Ａ２２１Ｈ、Ｌ２２３Ｖ、Ａ２２４Ｑ、Ｆ２２５Ｔ、Ｌ２２８Ｗ、Ｒ２３３Ｋ／Ｑ、Ｆ２３４Ｗ、Ｓ２５６Ｎ、Ｖ２６０Ａ／Ｃ／Ｌ、Ｖ２６９Ｉ／Ｌ／Ｍ、Ｎ２７２Ｃ／Ｇ、Ｔ２７４Ｑ及びＫ２７８Ａから選択される１以上の置換
（Ｃ’）配列番号４の番号付けでのＶ２６０Ａ／Ｃ／Ｌの置換とＬ１６Ｆ、Ｇ２２Ｍ、Ｔ４６Ｑ、Ｌ５０Ｉ／Ｖ、Ｋ１２３Ｉ、Ｒ１２６Ｅ、Ｌ１４２Ｆ、Ｇ１５６Ａ、Ｌ１９０Ｆ、Ｄ１９１Ａ／Ｅ、Ｌ２０８Ｃ、Ｍ２１２Ｌ、Ｖ２２０Ｈ、Ａ２２４Ｆ／Ｑ／Ｙ、Ｆ２２５Ｔ、Ｌ２２８Ｗ、Ｒ２３３Ｋ／Ｑ、Ｒ２３４Ｗ、Ｖ２６９Ｉ／Ｍ、Ｎ２７２Ｃ／Ｇ及びＫ２７８Ａから選択される１以上の置換
（Ｄ’）配列番号４の番号付けでのＬ２０８Ｃの置換とＬ１６Ｆ、Ｇ２２Ｃ、Ｌ５０Ｉ／Ｖ、Ｋ１２３Ｉ、Ｒ１２６Ｅ、Ｋ１８８Ｑ、Ｌ１９０Ｆ、Ｄ１９１Ａ、Ｍ２１２Ｌ、Ｖ２２０Ｈ、Ｌ２２３Ｖ、Ａ２２４Ｑ／Ｙ、Ｆ２２５Ｔ、Ｌ２２８Ｗ、Ｒ２３３Ｋ、Ｆ２３４Ｗ、Ｓ２５６Ｎ、Ｖ２６０Ａ／Ｃ／Ｌ、Ｖ２６９Ｉ、Ｎ２７２Ｃ／Ｇ、Ｋ２７８Ａ及びＲ２８６Ｍから選択される１以上の置換
【請求項５】
請求項１～４のいずれか１項に記載のリパーゼ変異体をコードするポリヌクレオチド。
【請求項６】
請求項５に記載のポリヌクレオチドを含むベクター又はＤＮＡ断片。
【請求項７】
請求項６に記載のベクター又はＤＮＡ断片を含有する形質転換細胞。
【請求項８】
微生物である、請求項７に記載の形質転換細胞。
【請求項９】
請求項１～４のいずれか１項に記載のリパーゼ変異体を含有する洗浄剤組成物。
【請求項１０】
配列番号４の番号付けでＬ１６、Ｇ２２、Ｙ２９、Ｙ４３、Ａ４５、Ｔ４６、Ｌ５０、Ｓ１２０、Ｋ１２３、Ｒ１２６、Ｔ１３４、Ｌ１４２、Ａ１４５、Ｇ１５６、Ｋ１７４、Ａ１８１、Ｑ１８６、Ｋ１８８、Ｌ１９０、Ｄ１９１、Ｌ２０８、Ｈ２０９、Ｍ２１２、Ｌ２１５、Ｖ２２０、Ａ２２１、Ｌ２２３、Ａ２２４、Ｆ２２５、Ｌ２２８、Ｒ２３３、Ｆ２３４、Ｓ２５６、Ｖ２６０、Ｌ２６６、Ｖ２６９、Ｎ２７２、Ｔ２７４、Ｋ２７８及びＲ２８６位に相当する位置から選択される１箇所以上の位置のアミノ酸残基を置換する工程を含む、リパーゼの安定性向上方法であって、前記リパーゼ又は前記リパーゼのアミノ酸残基置換後のリパーゼが配列番号４又は６で示されるアミノ酸配列に対して少なくとも８０％の配列同一性を有する、方法。

発明の詳細な説明【技術分野】
【０００１】
本発明は、リパーゼ変異体に関する。
続きを表示（約 2,100 文字）【背景技術】
【０００２】
リパーゼは、洗濯洗剤、食器用洗剤、油脂加工、パルプ処理、飼料、医薬中間体合成など様々な用途において有用である。洗浄においては、リパーゼは脂質中のエステル結合を加水分解して脂肪酸を生成することによって油を含む汚れの除去に寄与する。
【０００３】
洗浄用リパーゼは油性の汚れを除去するための洗浄剤組成物に採用されてきた。特許文献１には、スルホコハク酸アルキルエステルを含む洗浄剤をリパーゼと共に汚れと接触させた後、外力を加えずに放置することで油汚れを洗浄する方法が記載されている。また、特許文献２に記載のように、食器洗い用の洗浄剤組成物はステンレス製や樹脂製のシンク廻りの洗浄にも用いられることがあり、キッチンのシンク廻りに付着した水垢などを洗浄する機能を付与するには、クエン酸などのキレート剤を高濃度で配合することが考えられる。こうした洗浄剤の組成は、一般的な洗浄剤と比較して水分量が多く、溶剤を界面活性剤よりも多く含むといった特徴を有する。
【先行技術文献】
【特許文献】
【０００４】
特開２０２１－１７５０８号公報
特許第４７７６９９７号公報
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００５】
一般的な洗浄剤と比較して水分量が多く、溶剤を界面活性剤よりも多く含む洗浄剤組成物の酵素にとって過酷な環境において、配合したリパーゼの安定性は不明であったが、本発明者らが検討した結果、一般的な洗浄剤への配合時と比較して安定性が著しく低下することが明らかとなった。よって、本発明は、優れた安定性を示すリパーゼを提供することに関する。
【課題を解決するための手段】
【０００６】
本発明者らは、親リパーゼと比して、多量の水分及び／又は界面活性剤より多量の溶剤の存在下で安定性が向上したリパーゼ変異体を取得した。
【０００７】
すなわち、本発明は、下記１）～６）に係るものである。
１）配列番号４の番号付けでＬ１６、Ｇ２２、Ｙ２９、Ｙ４３、Ａ４５、Ｔ４６、Ｌ５０、Ｓ１２０、Ｋ１２３、Ｒ１２６、Ｔ１３４、Ｌ１４２、Ａ１４５、Ｇ１５６、Ｋ１７４、Ａ１８１、Ｑ１８６、Ｋ１８８、Ｌ１９０、Ｄ１９１、Ｌ２０８、Ｈ２０９、Ｍ２１２、Ｌ２１５、Ｖ２２０、Ａ２２１、Ｌ２２３、Ａ２２４、Ｆ２２５、Ｌ２２８、Ｒ２３３、Ｆ２３４、Ｓ２５６、Ｖ２６０、Ｌ２６６、Ｖ２６９、Ｎ２７２、Ｔ２７４、Ｋ２７８及びＲ２８６位に相当する位置から選択される１箇所以上の位置でのアミノ酸残基の置換を含む、親リパーゼの変異体であって、前記親リパーゼ又はリパーゼ変異体が配列番号４又は６で示されるアミノ酸配列に対して少なくとも８０％の配列同一性を有する、リパーゼ変異体。
２）１）に記載のリパーゼ変異体をコードするポリヌクレオチド。
３）２）に記載のポリヌクレオチドを含むベクター又はＤＮＡ断片。
４）３）に記載のベクター又はＤＮＡ断片を含有する形質転換細胞。
５）１）に記載のリパーゼ変異体を含有する洗浄剤組成物。
６）配列番号４の番号付けでＬ１６、Ｇ２２、Ｙ２９、Ｙ４３、Ａ４５、Ｔ４６、Ｌ５０、Ｓ１２０、Ｋ１２３、Ｒ１２６、Ｔ１３４、Ｌ１４２、Ａ１４５、Ｇ１５６、Ｋ１７４、Ａ１８１、Ｑ１８６、Ｋ１８８、Ｌ１９０、Ｄ１９１、Ｌ２０８、Ｈ２０９、Ｍ２１２、Ｌ２１５、Ｖ２２０、Ａ２２１、Ｌ２２３、Ａ２２４、Ｆ２２５、Ｌ２２８、Ｒ２３３、Ｆ２３４、Ｓ２５６、Ｖ２６０、Ｌ２６６、Ｖ２６９、Ｎ２７２、Ｔ２７４、Ｋ２７８及びＲ２８６位に相当する位置から選択される１箇所以上の位置のアミノ酸残基を置換する工程を含む、リパーゼの安定性向上方法であって、前記リパーゼ又は前記リパーゼのアミノ酸残基置換後のリパーゼが配列番号４又は６で示されるアミノ酸配列に対して少なくとも８０％の配列同一性を有する、方法。
【発明の効果】
【０００８】
本発明のリパーゼ変異体は、親リパーゼと比して安定性が向上している。斯かるリパーゼ変異体は、多量の水分及び／又は界面活性剤より多量の溶剤を含む洗浄剤組成物にも好適に配合することができる。
【発明を実施するための形態】
【０００９】
本明細書中で引用された全ての特許文献、非特許文献、及びその他の刊行物は、その全体が本明細書中において参考として援用される。
【００１０】
本明細書において、「リパーゼ」とは、トリアシルグリセロールリパーゼ（ＥＣ３．１．１．３）を指し、脂質中のエステル結合を加水分解して脂肪酸を生成する活性を有する酵素群を意味する。リパーゼ活性は、酪酸４－ニトロフェニルの加水分解による４－ニトロフェノールの遊離に伴う吸光度の増加速度を測定することによって決定することができる。リパーゼ活性の測定の具体的手順は、後述の実施例に詳述されている。
（【００１１】以降は省略されています）

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