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公開番号2025065059
公報種別公開特許公報(A)
公開日2025-04-17
出願番号2024173430
出願日2024-10-02
発明の名称細胞質送達ペプチド
出願人国立大学法人京都大学
代理人個人,個人
主分類C07K 14/00 20060101AFI20250410BHJP(有機化学)
要約【課題】本開示の1つの目的は、細胞質送達ペプチドを提供することである。
【解決手段】N末端から順に、酸性アミノ酸ドメイン、マストパランドメインおよび塩基性アミノ酸ドメインを含むか、または、N末端から順に、塩基性アミノ酸ドメイン、マストパランドメインおよび酸性アミノ酸ドメインを含み、酸性アミノ酸ドメインが1個～3個の酸性アミノ酸からなり、マストパランドメインが特定のアミノ酸配列と90%以上の同一性を有するアミノ酸配列からなり、塩基性アミノ酸ドメインが12個以上の塩基性アミノ酸からなる、細胞質送達ペプチドを提供する。
【選択図】なし
特許請求の範囲【請求項１】
細胞質送達ペプチドであって、
Ｎ末端から順に、酸性アミノ酸ドメイン、マストパランドメインおよび塩基性アミノ酸ドメインを含むか、または、Ｎ末端から順に、塩基性アミノ酸ドメイン、マストパランドメインおよび酸性アミノ酸ドメインを含み、
酸性アミノ酸ドメインが１個～３個の酸性アミノ酸からなり、
マストパランドメインが配列番号１のアミノ酸配列と９０％以上の同一性を有するアミノ酸配列からなり、
塩基性アミノ酸ドメインが１２個以上の塩基性アミノ酸からなる、
細胞質送達ペプチド。
続きを表示（約 610 文字）【請求項２】
Ｎ末端から順に、酸性アミノ酸ドメイン、マストパランドメインおよび塩基性アミノ酸ドメインを含む、請求項１に記載のペプチド。
【請求項３】
塩基性アミノ酸ドメインが、ヒスチジン、リシンおよびアルギニンから選択される１２個以上の塩基性アミノ酸からなる、請求項１に記載のペプチド。
【請求項４】
マストパランドメインが配列番号１のアミノ酸配列を含む、請求項１に記載のペプチド。
【請求項５】
酸性アミノ酸ドメインが少なくとも１個のＤ－アミノ酸を含む、請求項１に記載のペプチド。
【請求項６】
配列番号３、４および１９～２７のいずれかのアミノ酸配列と９０％以上の同一性を有するアミノ酸配列からなる、請求項１に記載のペプチド。
【請求項７】
配列番号３、４および１９～２７のいずれかのアミノ酸配列からなる、請求項１に記載のペプチド。
【請求項８】
配列番号３または４のアミノ酸配列と９０％以上の同一性を有するアミノ酸配列からなる、請求項１に記載のペプチド。
【請求項９】
配列番号３または４のアミノ酸配列からなる、請求項１に記載のペプチド。
【請求項１０】
システインを含むＳＳ結合配列がＣ末端に結合している、請求項１に記載のペプチド。
（【請求項１１】以降は省略されています）
発明の詳細な説明【技術分野】
【０００１】
本開示は、細胞質送達ペプチドに関するものである。
続きを表示（約 6,200 文字）【背景技術】
【０００２】
抗体などの高分子の医薬品候補物質が増加しているが、細胞膜を透過できないものが多く、その標的は細胞外分子や膜タンパク質の細胞外領域に限定される。細胞内にある分子を標的にするには、これらの物質を目的の細胞内に送り込む技術が必要である。既存の細胞質送達ペプチドは、例えば、特許文献１、非特許文献１および２などに開示されている。
【先行技術文献】
【特許文献】
【０００３】
特許第６２０２７０７号公報
【非特許文献】
【０００４】
Azuma, Y. et al. (2018) Angew. Chem. Int. Ed. 57, 12771-12774
Iwasaki, T. et al. (2015) J. Control. Release 210, 115-124
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００５】
本開示の目的は、改良された細胞質送達ペプチドを提供することである。
【課題を解決するための手段】
【０００６】
ある態様では、本開示は、細胞質送達ペプチドであって、
Ｎ末端から順に、酸性アミノ酸ドメイン、マストパランドメインおよび塩基性アミノ酸ドメインを含むか、または、Ｎ末端から順に、塩基性アミノ酸ドメイン、マストパランドメインおよび酸性アミノ酸ドメインを含み、
酸性アミノ酸ドメインが１個～３個の酸性アミノ酸からなり、
マストパランドメインが配列番号１のアミノ酸配列と９０％以上の同一性を有するアミノ酸配列からなり、
塩基性アミノ酸ドメインが１２個以上の塩基性アミノ酸からなる、
細胞質送達ペプチドを提供する。
【０００７】
ある態様では、本開示は、タンパク質に細胞質送達ペプチドを結合させる方法であって、
（１）システインを含むＳＳ結合配列がＣ末端に結合している上記ペプチドを提供すること、
（２）（１）のペプチドとＧ
ｎ
－（リンカー）－Ｃ（ｎは２以上の整数である）の構造を含むペプチドを接触させ、ジスルフィド結合を形成させること、
（３）ＬＰＸＴＧ（Ｘは任意のアミノ酸である）を含むアミノ酸配列がＣ末端に結合しているタンパク質を提供すること、
（４）（２）で得られたペプチドと（３）のタンパク質をソルターゼにより反応させること、
を含む方法を提供する。
【０００８】
ある態様では、本開示は、上記ペプチドをコードするポリヌクレオチドを提供する。
ある態様では、本開示は、上記ポリヌクレオチドを含むベクターを提供する。
ある態様では、本開示は、上記ポリヌクレオチドまたは上記ベクターを含む細胞を提供する。
ある態様では、本開示は、細胞内に物質を送達するための、上記ペプチドを含む組成物を提供する。
ある態様では、本開示は、細胞内に物質を送達する方法であって、上記ペプチドおよび細胞内に送達すべき物質を細胞にインビトロで接触させることを含む、方法を提供する。
【発明の効果】
【０００９】
本開示により、改良された細胞質送達ペプチドが提供される。
【図面の簡単な説明】
【００１０】
本開示の背景技術。ＭＰ（配列番号１）からＥ３ＭＰ（配列番号８）に構成を変更することにより、毒性が低下するものの、細胞内への取り込み効率も低下してしまう。さらに、Ｅ３ＭＰからＥ３－Ｄｐａ－ＭＰ（配列番号９）に構成を変更することにより、毒性は上がるものの、細胞内への取り込み効率は向上する。
本開示の細胞質送達ペプチドのデザイン。本開示の細胞質送達ペプチドによれば、低毒性と高い細胞内への取り込み効率が実現される。
Ｅ３ＭＰとＥ３ＭＰＨ１６のＨＴ１０８０細胞における細胞毒性。ＭＰ（空白のダイヤモンド；◇）、Ｅ３ＭＰ（空白の三角形；△）、およびＥ３ＭＰＨ１６（塗りつぶしの円形；●）を記載の濃度で１８時間ＨＴ１０８０細胞に処理した際の細胞毒性。Ｅ３ＭＰＨ１６は１００μＭでも細胞毒性を示さなかった。
Ｅ３ＭＰとＥ３ＭＰＨ１６のＨＴ１０８０細胞における細胞内取り込み。１０μＭのＥ３ＭＰＧＧＣ（Ａｌｅｘａ４８８）（Ｅ３ＭＰ（Ａｌｅｘａ））とＥ３ＭＰＨ１６ＧＧＣ（Ａｌｅｘａ４８８）（Ｅ３ＭＰＨ１６（Ａｌｅｘａ））を１時間ＨＴ１０８０細胞に処理した際の細胞内取り込みのフローサイトメトリーによる定量。Ｅ３ＭＰＨ１６はＥ３ＭＰと比べて４０倍の細胞内への取り込み促進が可能になった。
Ｅ３ＭＰＨ１６によるＤｅｘ－４８８の細胞質送達とエンドソーム脱出促進。（左）２００μｇ／ｍＬＤｅｘ－４８８と１０μＭの記載のペプチドで１８時間処理したＨＴ１０８０細胞の共焦点顕微鏡画像。（右）左の画像において細胞質でのＤｅｘ－４８８シグナルを有する細胞の割合。Ｅ３ＭＰＨ１６は血清存在下であっても蛍光標識されたデキストランを細胞質に送達した。
１０μＭＥ３ＭＰＨ１６を２００μｇ／ｍＬのＤｅｘ－４８８とともに１８時間様々な細胞に処理した際の共焦点顕微鏡画像。Ｅ３ＭＰＨ１６は様々な細胞種で細胞質にデキストランを送達した。
Ｅ３ＭＰＨ１６によるＮＬＳ－ＧＦＰの細胞質送達。５μＭのＮＬＳ－ＧＦＰと１０μＭのＥ３ＭＰＨ１６を添加して、１８時間インキュベートしたＨＴ１０８０細胞の共焦点顕微鏡画像。Ｅ３ＭＰＨ１６によって、核内移行シグナルを付与したＧＦＰを核内に導入することが可能になった。
Ｅ３ＭＰＨ１６による機能性タンパク質の細胞質送達。（上）Ｃｒｅ－ｌｏｘＰ組換えアッセイの模式図。（下）５μＭＣｒｅまたは５μＭＣｒｅおよび１０μＭＥ３ＭＰもしくはＥ３ＭＰＨ１６を２４時間処理したｌｏｘＰ－レポーターＨＥＫ２９３細胞における遺伝子組換え効率。Ｅ３ＭＰＨ１６によって細胞内に送達された組換えタンパク質Ｃｒｅは核内に移行して染色体上のｌｏｘｐサイトを認識して染色体ＤＮＡの組み換えを高効率で引き起こした。
Ｅ３ＭＰＨ１６による機能性タンパク質の細胞質送達。５００μｇ／ｍＬの抗ＧＦＰ抗体とＥ３ＭＰ１６を１８時間処理し、固定後に免疫染色したＨＴ１０８０細胞の共焦点顕微鏡画像。Ｅ３ＭＰＨ１６によって細胞内に送達された抗ＧＦＰ抗体は、細胞内で分解や変性などされることなく、細胞内のＧＦＰに特異的に結合した。
Ｅ３ＭＰＨ１６による機能性タンパク質の細胞質送達。５００μｇ／ｍＬまたは１６７μｇ／ｍＬの抗Ｒａｓ抗体と１０μＭＥ３ＭＰＨ１６を２４時間処理したＨＴ１０８０細胞における細胞増殖抑制効果。Ｅ３ＭＰＨ１６によって細胞内に導入された抗Ｒａｓ抗体は細胞内のＲａｓタンパク質に結合して細胞増殖を抑制した。
ソルターゼによるタンパク質とペプチドのコンジュゲート作製法の模式図。
ソルターゼによるタンパク質とペプチドのコンジュゲート作製。（左上）非還元ＳＤＳ－ＰＡＧＥによるタンパク質とペプチドのコンジュゲートの確認。（下）４μＭのＮＬＳ－ＧＦＰとＥ３ＭＰＨ１６のコンジュゲートをＨＴ１０８０細胞に添加して１８時間インキュベート後の共焦点顕微鏡画像。ＮＬＳ－ＧＦＰとＥ３ＭＰＨ１６のコンジュゲートにより、ＮＬＳ－ＧＦＰは高効率で核内に送達された。
（左）１０μＭの指定されたペプチドを２００μｇ／ｍＬのＤｅｘ－４８８とともに１８時間処理したＨＴ１０８０細胞の共焦点顕微鏡画像。（右）左の画像に基づき細胞質内に拡散したＤｅｘ－４８８シグナルを持つ細胞の割合。Ｅ３ＭＰのＣ末側に付加するポリヒスチジンのヒスチジン残基の数は、１２個になると細胞内への送達効率が上昇した。
Ｅ３ＭＰＨ１６のＮ末をＤ体にすることで活性が改善向上。１０μＭの指定されたペプチドを２００μｇ／ｍＬのＤｅｘ－４８８とともに１８時間処理したＨＴ１０８０細胞の共焦点顕微鏡画像。Ｅ３ＭＰＨ１６のＮ末側のグルタミン酸（Ｅ）残基をＤ体にすることにより（図中でＤ体のアミノ酸残基を小文字で表記する。）、細胞内への送達効率が向上した。
Ｅ３ＭＰＨ１６のＮ末をＤ体にすることで活性が改善向上。５μＭＣｒｅまたは５μＭＣｒｅおよび１０μＭの指定されたペプチドを２４時間処理したｌｏｘＰ－レポーターＨＥＫ２９３細胞における遺伝子組換え効率。Ｅ３ＭＰＨ１６のＮ末側のグルタミン酸（Ｅ）残基をＤ体にすることにより（図中でＤ体のアミノ酸残基を小文字で表記する。）、組換えタンパク質Ｃｒｅの細胞内への送達とこれに続く核内移行が促進され、染色体上のｌｏｘｐサイト認識を介した染色体ＤＮＡの組み換えを高効率で引き起こした。
担癌マウスにおける局所投与によるＮＬＳ－ＧＦＰのＥ３ＭＰＨ１６を介した細胞質送達（上）大腸－２６ゼノグラフト腫瘍モデルマウスへの局所投与によるＥ３ＭＰＨ１６によるＮＬＳ－ＧＦＰの配達の模式図。（下）大腸－２６ゼノグラフト腫瘍モデルマウスに５μＭのＮＬＳ－ＧＦＰ、５μＭのＮＬＳ－ＧＦＰおよびＥ３ＭＰＨ１６、または４μＭのＮＬＳ－ＧＦＰ－Ｅ３ＭＰＨ１６コンジュゲートを局所投与してから２４時間後、組織を収集し、パラフィンスライドを準備した。核をＤＡＰＩで染色し、それぞれの蛍光は共焦点顕微鏡によって観察した。画像中の白いボックスは拡大表示された領域を示す。ＮＬＳ－ＧＦＰによりＥ３ＭＰＨ１６はがん細胞の核内に移行した。
Ｅ３ＭＰＨ１６によるＤｅｘ－４８８の細胞質送達とエンドソーム脱出促進。１０μＭのＥ３ＭＰ１６と２００μｇ／ｍＬのＤｅｘ－４８８で記載の時間処理したＨＴ１０８０細胞の共焦点顕微鏡画像。Ｅ３ＭＰＨ１６はエンドソーム経路から被送達物質を細胞内に送達していることが判明した。
２００μｇ／ｍＬのＤｅｘ－４８８および１０μＭのＥ３ＭＰＨ１６で処理され、１時間のインキュベート後に洗浄されたＨＴ１０８０細胞の共焦点顕微鏡画像（右パネル）およびその後さらに２時間インキュベートしたＨＴ１０８０細胞の共焦点顕微鏡画像（左パネル）。Ｅ３ＭＰＨ１６はエンドソームから被送達物質を細胞内に送達していることが判明した。
Ｅ３ＭＰＨ１６の細胞質送達に関わる細胞内取り込み経路。クラスリン依存性エンドサイトーシス、カベオラ依存性エンドサイトーシスやマクロピノサイトーシスに対するエンドサイトーシス阻害剤で処理したＨＴ１０８０細胞において１０μＭのＥ３ＭＰＨ１６（Ａｌｅｘａ）を添加し、１時間インキュベートした際の細胞内取り込み量。Ｅ３ＭＰＨ１６による被送達物質の細胞内送達にはエンドサイトーシスが関与することが判明した。
Ｅ３ＭＰＨ１６の細胞質送達に関わる細胞内取り込み経路。（左）エンドサイトーシス阻害剤を３０分、ＨＴ１０８０細胞に処理したのちに、エンドサイトーシス阻害剤と１０μＭＥ３ＭＰＨ１６と２００μｇ／ｍＬＤｅｘ－４８８を共にＨＴ１０８０細胞に添加し、１時間インキュベートした際の共焦点顕微鏡画像。（右）左の画像において細胞質全体にＤｅｘ－４８８シグナルが拡散した細胞の割合。Ｅ３ＭＰＨ１６によるエンドサイトーシスを介した被送達物質の細胞内送達には、マクロピノおよびカベオラ経路が関与することが判明した。
Ｅ３ＭＰＨ１６によるＤｅｘ－４８８の細胞質送達とエンドソーム脱出促進。（左）２００μｇ／ｍＬのＤｅｘ－４８８と１０μＭＥ３ＭＰＨ１６を４℃もしくは３７℃で３時間処理したＨＴ１０８０細胞の共焦点顕微鏡画像。（右）左の画像において細胞質全体にＤｅｘ－４８８シグナルが拡散した細胞の割合。Ｅ３ＭＰＨ１６による被送達物質の細胞内送達は４℃で抑制され、Ｅ３ＭＰＨ１６はエンドソーム経路から被送達物質を送達することが判明した。
Ｅ３ＭＰＨ１６の細胞質送達に関わる細胞内取り込み経路。（左）２０ｎＭコンカナマイシンで処置したのちに、２０ｎＭコンカナマイシン、１０μＭＥ３ＭＰＨ１６と２００μｇ／ｍＬＤｅｘ－４８８を添加し、３時間インキュベートしたＨＴ１０８０細胞の共焦点顕微鏡画像。（右）左の画像において細胞質全体にＤｅｘ－４８８シグナルが拡散した細胞の割合。Ｅ３ＭＰＨ１６による被送達物質の細胞内送達にはエンドソームの酸性化が重要であることが判明した。
Ｅ３ＭＰＨ１６の細胞質送達に関わる細胞内取り込み経路。各種Ｒａｂ５変異体を発現させたＨＴ１０８０細胞に対して１０μＭＥ３ＭＰＨ１６と２００μｇ／ｍＬＤｅｘ４８８を処理した際の共焦点顕微鏡画像。Ｒａｂ５Ｑ７９Ｌを発現させても、Ｄｅｘ－４８８の細胞質送達に影響はほとんど見られなかったが、Ｒａｂ５Ｓ３４Ｎを発現させることでＤｅｘ－４８８の細胞質送達がほとんど見られなくなった。Ｅ３ＭＰＨ１６による被送達物質の細胞内送達には初期エンドソームが重要であることが判明した。初期エンドソームへの移行を阻害すると、被送達物質が細胞質内で拡散できなくなることが判明した。
ＨＴ１０８０細胞におけるＥ３ＭＰＨ１６（Ａｌｅｘａ）とリソソームマーカーLysoTracker redの共局在。１０μＭのＥ３ＭＰＨ１６（Ａｌｅｘａ）を１時間インキュベートした後、ＨＴ１０８０細胞をLysotracker redで染色し、共焦点顕微鏡で生細胞画像を得た。Ｅ３ＭＰＨ１６（Ａｌｅｘａ）はリソソームに局在化した。
ＭＰ（空白のダイヤモンド；◇）、Ｅ３ＭＰ（空白の三角形；△）、およびＥ３ＭＰＨ１６（塗りつぶしの円形；●）によって誘発されるリポソームリーケージアッセイ。ＣＭ（左）およびＥＭ（右）は、細胞およびエンドソーム膜を模倣したリポソームを示す。Ｅ３ＭＰＨ１６は酸性脂質に対して障害性を発揮することが判明した。
異なる酸性アミノ酸をＮ末端に導入した時の影響。１０μＭの指定されたペプチドを２００μｇ／ｍＬのＤｅｘ－４８８とともに１８時間処理したＨＴ１０８０細胞の共焦点顕微鏡画像。Ｅ３ＭＰＨ１６のＮ末端の３個のグルタミン酸をアスパラギン酸（Ｄ）または２－アミノアジピン酸（Ａａｄ）に置換しても、細胞内送達能は維持された。
Ｈ１６ＭＰＥ３のＨＴ１０８０細胞における細胞毒性。Ｈ１６ＭＰＥ３を記載の濃度で１８時間ＨＴ１０８０細胞に処理した際の細胞毒性。Ｈ１６ＭＰＥ３は１００μＭでも細胞毒性を示さなかった。
Ｈ１６ＭＰＥ３によるＤｅｘ－４８８の細胞質送達。（上）２００μｇ／ｍＬＤｅｘ－４８８と１０μＭの記載のペプチドで１８時間処理したＨＴ１０８０細胞の共焦点顕微鏡画像。（下）上の画像において細胞質でのＤｅｘ－４８８シグナルを有する細胞の割合。Ｈ１６ＭＰＥ３はＥ３ＭＰＨ１６と同等に蛍光標識されたデキストランを細胞質に送達した。
【発明を実施するための形態】
（【００１１】以降は省略されています）

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