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公開番号2025071369
公報種別公開特許公報(A)
公開日2025-05-02
出願番号2025030465,2023183244
出願日2025-02-27,2019-12-10
発明の名称核酸増幅方法、核酸増幅装置及び核酸増幅用チップ
出願人杏林製薬株式会社
代理人弁理士法人三枝国際特許事務所
主分類C12M 1/00 20060101AFI20250424BHJP(生化学;ビール;酒精;ぶどう酒;酢;微生物学;酵素学;突然変異または遺伝子工学)
要約【課題】新たな送液制御機構を用いた核酸増幅方法を提供すること
【解決手段】以下の工程を含む、核酸増幅用チップ及び前記核酸増幅用チップを載置可能な基板を備える核酸増幅装置を用いる核酸増幅方法:工程1:核酸増幅装置の基板上に核酸増幅用チップを載置する工程であって、当該核酸増幅装置が、第1及び第2ヒーター、送液用機構、第1及び第2四方向弁、第1及び第2二方向弁、制御装置、第1及び第2接続部、第1～第9流路を備え、前記核酸増幅用チップが第1及び第2曲線流路、中間流路、接続部、第1及び第2接続流路を備える工程、工程2:核酸増幅用チップにおける接続部と核酸増幅装置における第1及び第2接続部とを接続する工程、工程3:前記送液用機構により試料液に第1曲線流路と第2曲線流路とを中間流路を介して往復させてサーマルサイクリングを行う工程。
【選択図】図1
特許請求の範囲【請求項１】
以下の工程を含む、核酸増幅用チップ（２）及び前記核酸増幅用チップ（２）を載置可能な基板（３）を備える核酸増幅装置（１）を用いる核酸増幅方法：
工程１：核酸増幅装置（１）の基板（３）上に核酸増幅用チップ（２）を載置する工程であって、
当該核酸増幅装置（１）が、
変性温度帯を形成できる第１ヒーター（４）、
伸長・アニーリング温度帯を形成できる第２ヒーター（５）、
前記変性温度帯と前記伸長・アニーリング温度帯との間の試料液（３０）の移動を可能にする送液用機構（６）、
第１四方向弁（７）及び第２四方向弁（８）、
第１二方向弁（９）及び第２二方向弁（１０）、
第１四方向弁、第２四方向弁、第１二方向弁及び第２二方向弁の切り替えを制御する制御装置（１１）、
前記核酸増幅用チップ（２）に接続可能な第１接続部（１２）、
前記核酸増幅用チップ（２）に接続可能な第２接続部（１３）、
前記送液用機構と第１四方向弁及び第２四方向弁とを接続する第１流路（１４）、
一端が前記第１四方向弁（７）に接続され、他端が前記第１接続部（１２）に接続されている第２流路（１５）、
一端が前記第２四方向弁（８）に接続され、他端が前記第２接続部（１３）に接続されている第３流路（１６）、
一端が前記第１四方向弁に（７）接続され、他端が前記第１二方向弁（９）に接続されている第４流路（１７）、
一端が前記第２四方向弁（８）に接続され、他端が前記第２二方向弁（１０）に接続されている第５流路（１８）、
一端が前記第１二方向弁（９）に接続され、他端が流路外に開放されている第６流路（１９）、
一端が前記第２二方向弁（１０）に接続され、他端が流路外に開放されている第７流路（２０）、
一端が前記第１四方向弁（７）に接続され、他端が流路外に開放されている第８流路（２１）、及び
一端が前記第２四方向弁（８）に接続され、他端が流路外に開放されている第９流路（２２）、
を備え、サーマルサイクル毎の蛍光強度の計測を行うことでリアルタイムＰＣＲを行うことを特徴とするレシプロカルフロー型の核酸増幅装置（１）であり、
前記核酸増幅用チップ（２）が、前記変性温度帯と前記伸長・アニーリング温度帯とに各々対応する第１曲線流路（２３）及び第２曲線流路（２４）、当該第１曲線流路（２３）及び第２曲線流路（２４）をつなぐ中間流路（２５）、前記核酸増幅装置に接続可能な２つの接続部（２６、２７）、第１曲線流路（２３）と接続部（２６）とをつなぐ第１接続流路（２８）、及び第２曲線流路（２４）と接続部（２７）とをつなぐ第２接続流路（２９）を備える、工程、
工程２：核酸増幅用チップ（２）における接続部（２６、２７）と核酸増幅装置における第１接続部（１２）及び第２接続部（１３）とを接続する工程、
工程３：前記送液用機構により試料液に第１曲線流路（２３）と第２曲線流路（２４）とを中間流路（２５）を介して往復させてサーマルサイクリングを行う工程、及び
ただし、工程３において試料液（３０）を前記第１ヒーター（４）側から第２ヒーター（５）側に移動させる場合には第１流路（１４）と第２流路（１５）とを通じ、第４流路（１７）と第８流路（２１）とを通じさせるように前記第１四方向弁（７）を制御し、第１流路（１４）と第５流路（１８）とを通じ、第３流路（１６）と第９流路（２２）とを通
じさせるように前記第２四方向弁（８）を制御し、かつ第２二方向弁（１０）を閉じた状態とし、第１二方向弁（９）を閉じた状態又は開いた状態とし、
工程３において試料液（３０）を前記第２ヒーター（５）側から第１ヒーター（４）側に移動させる場合には第１流路（１４）と第３流路（１６）とを通じ、第５流路（１８）と第９流路（２２）とを通じさせるように前記第２四方向弁（８）を制御し、第１流路（１４）と第４流路（１７）とを通じ、第２流路（１５）と第８流路（２１）とを通じさせるように前記第１四方向弁（７）を制御し、第１二方向弁（９）を閉じた状態とし、かつ第２二方向弁（１０）を閉じた状態又は開いた状態とし、
工程３において試料液（３０）の移動を止める場合には、第１流路（１４）と第４流路（１７）とを通じ、第２流路（１５）と第８流路（２１）とを通じさせるように前記第１四方向弁（７）を制御し、第１流路（１４）と第５流路（１８）を通じ、第３流路（１６）と第９流路（２２）とを通じさせるように前記第２四方向弁（８）を制御し、かつ第１二方向弁及び／又は第２二方向弁を開けた状態とする。
続きを表示（約 3,600 文字）【請求項２】
請求項１に記載の方法であって、前記核酸増幅装置（１）が、前記中間流路（２５）を通過する試料液（３０）の蛍光強度を測定可能な蛍光検出器をさらに備え、
前記方法が、工程４：前記中間流路（２５）の所定の位置で前記蛍光検出器によりサーマルサイクル毎の試料液（３０）の蛍光強度の計測を行う工程をさらに含む、方法。
【請求項３】
前記工程３において、前記制御装置に試料液（３０）の移動に関する前記蛍光検出器からの電気信号が送られ、当該電気信号に基づき、中間流路の試料液（３０）の通過を制御装置が感知し、第１四方向弁、第２四方向弁、第１二方向弁及び第２二方向弁の切り替えを制御する、請求項２に記載の方法。
【請求項４】
核酸増幅用チップ（２）を載置可能な基板（３）、
変性温度帯を形成できる第１ヒーター（４）、
伸長・アニーリング温度帯を形成できる第２ヒーター（５）、
前記変性温度帯と前記伸長・アニーリング温度帯との間の試料液（３０）の移動を可能にする送液用機構（６）、
第１四方向弁（７）及び第２四方向弁（８）、
第１二方向弁（９）及び第２二方向弁（１０）、
第１四方向弁、第２四方向弁、第１二方向弁及び第２二方向弁の切り替えを制御する制御装置（１１）、
前記核酸増幅用チップ（２）に接続可能な第１接続部（１２）、
前記核酸増幅用チップ（２）に接続可能な第２接続部（１３）、
前記送液用機構（６）と第１四方向弁及び第２四方向弁とを接続する第１流路（１４）、一端が前記第１四方向弁（７）に接続され、他端が前記第１接続部（１２）に接続されている第２流路（１５）、
一端が前記第２四方向弁（８）に接続され、他端が前記第２接続部（１３）に接続されている第３流路（１６）、
一端が前記第１四方向弁（７）に接続され、他端が前記第１二方向弁（９）に接続されている第４流路（１７）、
一端が前記第２四方向弁（８）に接続され、他端が前記第２二方向弁（１０）に接続されている第５流路（１８）、
一端が前記第１二方向弁（９）に接続され、他端が流路外に開放されている第６流路（１９）、
一端が前記第２二方向弁（１０）に接続され、他端が流路外に開放されている第７流路（２０）、
一端が前記第１四方向弁（７）に接続され、他端が流路外に開放されている第８流路（２１）、及び
一端が前記第２四方向弁（８）に接続され、他端が流路外に開放されている第９流路（２２）、
を備え、サーマルサイクル毎の蛍光強度の計測を行うことでリアルタイムＰＣＲを行うことを特徴とするレシプロカルフロー型の核酸増幅装置（１）。
【請求項５】
以下の工程を含む、核酸増幅用チップ（２’）及び前記核酸増幅用チップ（２’）を載置可能な基板（３’）を備える核酸増幅装置（１’）を用いる核酸増幅方法：
工程１：核酸増幅装置（１’）の基板（３’）上に核酸増幅用チップ（２’）を載置する工程であって、
当該核酸増幅装置（１’）が、
変性温度帯を形成できる第１ヒーター（４’）、
伸長・アニーリング温度帯を形成できる第２ヒーター（５’）、
前記変性温度帯と前記伸長・アニーリング温度帯との間の試料液（３０’）の移動を可能にする送液用機構（６’）、
第１三方向弁（７’）及び第２三方向弁（８’）、
第１三方向弁（７’）、第２三方向弁（８’）、送液用機構（６’）の駆動を制御する制御装置（１１’）、
前記核酸増幅用チップ（２’）に接続可能な第１接続部（１２’）、
前記核酸増幅用チップ（２’）に接続可能な第２接続部（１３’）、
前記送液用機構と第１三方向弁（７’）及び第２三方向弁（８’）とを接続する第１流路（１４’）、
一端が前記第１三方向弁（７’）に接続され、他端が前記第１接続部（１２’）に接続されている第２流路（１５’）、
一端が前記第２三方向弁（８’）に接続され、他端が前記第２接続部（１３’）に接続されている第３流路（１６’）、
一端が前記第１三方向弁（７’）に接続され、他端が流路外に開放されている第４流路（２１”）、及び
一端が前記第２三方向弁（８’）に接続され、他端が流路外に開放されている第５流路（２２”）
を備え、サーマルサイクル毎の蛍光強度の計測を行うことでリアルタイムＰＣＲを行うことを特徴とするレシプロカルフロー型の核酸増幅装置（１’）であり、
前記核酸増幅用チップ（２’）が、前記変性温度帯と前記伸長・アニーリング温度帯とに各々対応する第１曲線流路（２３’）及び第２曲線流路（２４’）、当該第１曲線流路（２３’）及び第２曲線流路（２４’）をつなぐ中間流路（２５’）、前記核酸増幅装置に接続可能な２つの接続部（２６’、２７’）、第１曲線流路（２３’）と接続部とをつなぐ第１接続流路（２８’）、及び第２曲線流路（２４’）と接続部とをつなぐ第２接続流路（２９’）を備える、工程、
工程２：核酸増幅用チップ（２’）における接続部（２６’、２７’）と核酸増幅装置（１’）における第１接続部（１２’）及び第２接続部（１３’）とを接続する工程、
工程３：前記送液用機構により試料液を第一曲線流路（２３’）と第２曲線流路（２４’）とを中間流路（２５’）を介して往復させてサーマルサイクリングを行う工程、及びただし、工程３において試料液（３０’）を前記第１ヒーター（４’）側から第２ヒーター（５’）側に移動させる場合には第１流路（１４’）と第２流路（１５’）とを通じさせ、第４流路（２１”）は第１流路（１４’）及び第２流路（１５’）とは通じていない状態になるように前記第１三方向弁（７’）を制御し、第３流路（１６）と第５流路（２２”）とを通じさせ、第１流路（１４’）は第３流路（１６’）と第５流路（２２”）とは通じていない状態になるように前記第２三方向弁（８’）を制御し、試料液が前記中間流路（２５’）を通過する速度が１００ｍｍ／ｓ以下となるように送液用機構（６’）が制御され、
工程３において試料液（３０’）を前記第２ヒーター（５’）側から第１ヒーター（４’
）側に移動させる場合には第１流路（１４’）と第３流路（１６’）とを通じさせ、第５流路（２２”）は第１流路（１４’）及び第３流路（１６’）とは通じていない状態になるように前記第２三方向弁（８’）を制御し、第２流路（１５’）と第４流路（２１”）とを通じさせ、第１流路（１４’）は第２流路（１５’）と第４流路（２１”）とは通じていない状態になるように前記第１三方向弁（７’）を制御し、試料液（３０’）が前記中間流路（２５’）を通過する速度が１００ｍｍ／ｓ以下となるように送液用機構（６’）が制御され、
工程３において試料液（３０’）の移動を止める場合には、第２流路（１５’）と第４流路（２１”）とを通じさせ、第１流路（１４’）は第２流路（１５’）と第４流路（２１”）とは通じていない状態になるように前記第１三方向弁（７’）を制御し、第３流路（１６’）と第５流路（２２”）とを通じさせ、第１流路（１４’）は第３流路（１６’）と第５流路（２２”）とは通じていない状態になるように前記第２三方向弁（８’）を制御し、かつ前記第１三方向弁（７’）及び前記第２三方向弁（８’）の両弁を前記状態に制御後２秒以内に送液用機構（６’）を停止させる。
【請求項６】
請求項５に記載の方法であって、前記核酸増幅装置（１’）が、前記中間流路（２５’）を通過する前記試料液（３０’）の蛍光強度を測定可能な蛍光検出器を備え、
前記方法が、前記中間流路（２５’）の所定の位置で前記蛍光検出器によりサーマルサイクル毎の試料液の蛍光強度の計測を行う工程を含む、方法。
【請求項７】
前記工程３において、前記制御装置（１１’）に試料液（３０’）の移動に関する蛍光検出器からの電気信号が送られ、当該電気信号に基づき、中間流路（２５’）の試料液（３０’）の通過を制御装置が感知し、第１三方向弁（７’）、第２三方向弁（８’）、送液用機構（６’）の駆動を制御する、請求項６に記載の方法。
【請求項８】
前記第１流路（１４’）の内部断面が、第１曲線流路（２３’）、第２曲線流路（２４’）及び中間流路（２５’）の内部断面より大きい流路である、請求項５～７のいずれか一項に記載の方法。

発明の詳細な説明【技術分野】
【０００１】
本発明は、核酸増幅方法、核酸増幅装置及び核酸増幅用チップに関する。
続きを表示（約 3,100 文字）【背景技術】
【０００２】
核酸の検出は、医学分野（医薬品の研究開発、臨床検査、法医学等）、農学分野（農作物、病原性微生物の種類の同定等）、様々な分野において中核となるものである。そして、ＤＮＡのある特定領域を選択的に増幅するＰＣＲ法は、核酸検出のための非常に有用な技術である。
【０００３】
汎用のＰＣＲ及びリアルタイムＰＣＲ用サーマルサイクラーにおける巨大な熱容量に起因してＰＣＲ反応に長時間を要するという課題があったところ流路チップを用いて複数の温度帯上へ繰り返し送液することでサーマルサイクルを高速化する手法が開発されている（特許文献１）。
【先行技術文献】
【特許文献】
【０００４】
特許第6226284号
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００５】
本発明の目的は、新たな送液制御機構を用いた核酸増幅方法を提供することである。
【課題を解決するための手段】
【０００６】
本発明者らは、流路チップの試料送液の制御をポンプではなく、切換弁を用いて行うことを検討した。しかしながら、ポンプを駆動させたままで切換弁の開閉を行うと、ポンプに直接接続された流路では空気の逃げ場がなく流路内圧力が過剰となるためポンプ破損・劣化の原因となる。
そこで、本発明者は、送液用機構を１つ有する核酸増幅装置において、四方向弁とともに二方向弁を用いることにより、流路内圧力の上昇を回避できることを見出した。
【０００７】
さらに本発明者らは、かかる新規の知見に基づき、送液用機構と２種類の弁をつなぐ流路の配置等を適宜修正することにより、本発明を完成するに至った。
【０００８】
従って、本発明の１つは以下の項を提供する：
項１．以下の工程を含む、核酸増幅用チップ（２）及び前記核酸増幅用チップ（２）を載置可能な基板（３）を備える核酸増幅装置（１）を用いる核酸増幅方法：
工程１：核酸増幅装置（１）の基板（３）上に核酸増幅用チップ（２）を載置する工程であって、
当該核酸増幅装置（１）が、
変性温度帯を形成できる第１ヒーター（４）、
伸長・アニーリング温度帯を形成できる第２ヒーター（５）、
前記変性温度帯と前記伸長・アニーリング温度帯との間の試料液（３０）の移動を可能にする送液用機構（６）、
第１四方向弁（７）及び第２四方向弁（８）、
第１二方向弁（９）及び第２二方向弁（１０）、
第１四方向弁、第２四方向弁、第１二方向弁及び第２二方向弁の切り替えを制御する制御装置（１１）、
前記核酸増幅用チップ（２）に接続可能な第１接続部（１２）、
前記核酸増幅用チップ（２）に接続可能な第２接続部（１３）、
前記送液用機構と第１四方向弁及び第２四方向弁とを接続する第１流路（１４）、
一端が前記第１四方向弁（７）に接続され、他端が前記第１接続部（１２）に接続されている第２流路（１５）、
一端が前記第２四方向弁（８）に接続され、他端が前記第２接続部（１３）に接続されている第３流路（１６）、
一端が前記第１四方向弁に（７）接続され、他端が前記第１二方向弁（９）に接続されている第４流路（１７）、
一端が前記第２四方向弁（８）に接続され、他端が前記第２二方向弁（１０）に接続されている第５流路（１８）、
一端が前記第１二方向弁（９）に接続され、他端が流路外に開放されている第６流路（１９）、
一端が前記第２二方向弁（１０）に接続され、他端が流路外に開放されている第７流路（２０）、
一端が前記第１四方向弁（７）に接続され、他端が流路外に開放されている第８流路（２１）、及び
一端が前記第２四方向弁（８）に接続され、他端が流路外に開放されている第９流路（２２）、
を備え、サーマルサイクル毎の蛍光強度の計測を行うことでリアルタイムＰＣＲを行うことを特徴とするレシプロカルフロー型の核酸増幅装置（１）であり、
前記核酸増幅用チップ（２）が、前記変性温度帯と前記伸長・アニーリング温度帯とに各々対応する第１曲線流路（２３）及び第２曲線流路（２４）、当該第１曲線流路（２３）及び第２曲線流路（２４）をつなぐ中間流路（２５）、前記核酸増幅装置に接続可能な２つの接続部（２６、２７）、第１曲線流路（２３）と接続部（２６）とをつなぐ第１接続流路（２８）、及び第２曲線流路（２４）と接続部（２７）とをつなぐ第２接続流路（２９）を備える、工程、
工程２：核酸増幅用チップ（２）における接続部（２６、２７）と核酸増幅装置における第１接続部（１２）及び第２接続部（１３）とを接続する工程、
工程３：前記送液用機構により試料液に第１曲線流路（２３）と第２曲線流路（２４）とを中間流路（２５）を介して往復させてサーマルサイクリングを行う工程、及び
ただし、工程３において試料液（３０）を前記第１ヒーター（４）側から第２ヒーター（５）側に移動させる場合には第１流路（１４）と第２流路（１５）とを通じ、第４流路（１７）と第８流路（２１）とを通じさせるように前記第１四方向弁（７）を制御し、第１流路（１４）と第５流路（１８）とを通じ、第３流路（１６）と第９流路（２２）とを通じさせるように前記第２四方向弁（８）を制御し、かつ第２二方向弁（１０）を閉じた状態とし、第１二方向弁（９）を閉じた状態又は開いた状態とし、
工程３において試料液（３０）を前記第２ヒーター（５）側から第１ヒーター（４）側に移動させる場合には第１流路（１４）と第３流路（１６）とを通じ、第５流路（１８）と第９流路（２２）とを通じさせるように前記第２四方向弁（８）を制御し、第１流路（１４）と第４流路（１７）とを通じ、第２流路（１５）と第８流路（２１）とを通じさせるように前記第１四方向弁（７）を制御し、第１二方向弁（９）を閉じた状態とし、かつ第２二方向弁（１０）を閉じた状態又は開いた状態とし、
工程３において試料液（３０）の移動を止める場合には、第１流路（１４）と第４流路（１７）とを通じ、第２流路（１５）と第８流路（２１）とを通じさせるように前記第１四方向弁（７）を制御し、第１流路（１４）と第５流路（１８）を通じ、第３流路（１６）と第９流路（２２）とを通じさせるように前記第２四方向弁（８）を制御し、かつ第１二方向弁及び／又は第２二方向弁を開けた状態とする。
【０００９】
項２．項１に記載の方法であって、前記核酸増幅装置（１）が、前記中間流路（２５）
を通過する試料液（３０）の蛍光強度を測定可能な蛍光検出器をさらに備え、
前記方法が、工程４：前記中間流路（２５）の所定の位置で前記蛍光検出器によりサーマルサイクル毎の試料液（３０）の蛍光強度の計測を行う工程をさらに含む、方法。
【００１０】
項３．前記工程３において、前記制御装置に試料液（３０）の移動に関する前記蛍光検出器からの電気信号が送られ、当該電気信号に基づき、中間流路の試料液（３０）の通過を制御装置が感知し、第１四方向弁、第２四方向弁、第１二方向弁及び第２二方向弁の切り替えを制御する、項２に記載の方法。
（【００１１】以降は省略されています）

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