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公開番号2025085926
公報種別公開特許公報(A)
公開日2025-06-06
出願番号2023199638
出願日2023-11-27
発明の名称核酸検出用PCR溶液
出願人杏林製薬株式会社
代理人
主分類C12Q 1/686 20180101AFI20250530BHJP(生化学;ビール;酒精;ぶどう酒;酢;微生物学;酵素学;突然変異または遺伝子工学)
要約【課題】
生体試料から核酸成分を分離、精製することなく直接核酸増幅することが可能な核酸増
幅用組成物を提供する。
【解決手段】
以下の成分(A)～(D)を含有し、生体試料から核酸成分の単離精製をしないで核酸を増幅することを特徴とする核酸増幅用組成物。
(A)DNAポリメラーゼ
(B)フォワードプライマー及びリバースプライマー
(C)尿素
(D)RNase 阻害剤
【選択図】図3
特許請求の範囲【請求項１】
以下の成分（Ａ）～（Ｄ）を含有し、生体試料から核酸成分の単離精製をしないで核酸を増幅することを特徴とする核酸増幅用組成物。
（Ａ）ＤＮＡポリメラーゼ
（Ｂ）フォワードプライマー及びリバースプライマー
（Ｃ）尿素
（Ｄ）ＲＮａｓｅ阻害剤
続きを表示（約 740 文字）【請求項２】
レシプロカルフロー型の核酸増幅装置を用いることを特徴とする、１）記載の核酸増幅用組成物。
【請求項３】
さらに（Ｅ）蛍光色素で標識されたプローブ、（Ｆ）非イオン界面活性剤、及び（Ｇ）無機塩からなる群より選択される少なくとも１つを含有する、１）又は２）記載の核酸増幅用組成物。
【請求項４】
以下の成分（Ａ）～（Ｄ）を含有する、生体試料から核酸成分の単離精製をしないで核酸を増幅するためのキット。
（Ａ）ＤＮＡポリメラーゼ
（Ｂ）フォワードプライマー及びリバースプライマー
（Ｃ）尿素
（Ｄ）ＲＮａｓｅ阻害剤
【請求項５】
レシプロカルフロー型の核酸増幅装置を用いることを特徴とする、４）記載のキット。
【請求項６】
さらに（Ｃ）蛍光色素で標識されたプローブ、（Ｆ）非イオン界面活性剤、及び（Ｇ）無機塩からなる群より選択される少なくとも１つを含有してなる４）又は５）記載のキット。
【請求項７】
核酸増幅方法であって、下記（I）～（II）の工程を含む方法。
（I）１）に記載の組成物と鋳型になる核酸分子を含む組成物を調製する工程；及び
（II）工程（I）により得られた組成物を適切な条件下で反応させ、核酸増幅を行う工程
【請求項８】
レシプロカルフロー型の核酸増幅装置を用いることを特徴とする、７）記載の核酸増幅方法。
【請求項９】
さらに（Ｅ）蛍光色素で標識されたプローブ、（Ｆ）非イオン界面活性剤、及び（Ｇ）無機塩からなる群より選択される少なくとも１つを含有する、７）又は８）記載の核酸増幅方法。

発明の詳細な説明【技術分野】
【０００１】
本発明は、ウイルス、バクテリア等の感染、ならびに各種遺伝子疾患の検出を行うリアルタイムＰＣＲの分野において、生体試料からの核酸成分の精製工程を経ることなく、直接遺伝子検出を可能とする組成物に関する。なお、本明細書に記載される文献は、下記先行技術文献（特許文献及び非特許文献）として挙げた文献を含め、全ての文献につき、記載される全ての内容が、参照により本明細書に組み込まれる。
続きを表示（約 1,500 文字）【背景技術】
【０００２】
核酸の検出は、医薬品の研究開発、法医学、臨床検査、農作物や病原性微生物の種類の同定など、様々な分野において中核をなしている。当該核酸の検出のために、ＰＣＲ（polymerase chain reaction）が広く用いられている。ＰＣＲはＤＮＡのある特定領域を選択的に増幅する技術である。具体的には、サーマルサイクルと呼ばれる三相もしくは二相の温度条件を繰り返すことにより、単一鎖へのＤＮＡの変性、変性されたＤＮＡ一本鎖とプライマーのアニーリング、及び熱安定性ＤＮＡポリメラーゼ酵素によるプライマーの伸長という個々の反応を順次繰り返すことによりＤＮＡを増幅する。
【０００３】
また、ＰＣＲにより増幅されたＤＮＡの検出を容易とするリアルタイムＰＣＲが開発されている。
【０００４】
ＰＣＲは目的のＤＮＡを選択的に増幅できるが、増幅したＤＮＡを確認するためには、ＰＣＲの終了後に別途ゲル電気泳動などによる確認作業が必要であった。リアルタイムＰＣＲでは目的のＤＮＡの増幅量に合わせ蛍光を発生もしくは消光させることにより、試料中の目的のＤＮＡの有無を簡便に確認できるようになった。
【０００５】
また、従来のＰＣＲでは、ＰＣＲ前の試料中のテンプレートＤＮＡ量が一定量を超えると、ＰＣＲ後の増幅ＤＮＡ量はプラトーに達していることが多く、ＰＣＲ前のテンプレートＤＮＡ量を定量することはできない。しかし、リアルタイムＰＣＲにおいては、プラトーに達する前に、ＰＣＲ途中の増幅ＤＮＡ量をリアルタイムに検出できるため、ＤＮＡ増幅の様子からＰＣＲ前のテンプレートＤＮＡ量を定量することが可能である。そのためリアルタイムＰＣＲは、定量的ＰＣＲとも呼ばれる。
【０００６】
ＰＣＲに使用される汎用のサーマルサイクラー装置は、ヒーターであるアルミブロック部の巨大な熱容量のため温度制御が遅く、３０～４０サイクルのＰＣＲ操作に従来１～２時間、場合によってはそれ以上を要する。そのため、最新の遺伝子検査装置を用いても分析にはトータルで、通常１時間以上を要しており、ＰＣＲ操作の高速化は、技術登場以来の大きな課題であった。
【０００７】
ＰＣＲの高速化のための手法として、レシプロカルフロー型の核酸増幅装置が提案されている（特許文献１）。
【０００８】
レシプロカルフロー型の核酸増幅装置を用いるＰＣＲにおいては、マイクロブロア等の送液機構を使用し、中間流路を介して連通している変性温度帯に維持されている流路と伸長およびアニーリング温度帯に維持されている流路との間で試料液を行き来させ、短時間でのＤＮＡ増幅を可能としている。
【０００９】
しかしながら、ＰＣＲ法は、タンパク質、糖類や未知の夾雑物によって反応が阻害されることがある。すなわち、多くのＤＮＡポリメラーゼは、生体由来の夾雑物がＰＣＲ反応液中に混在すると、活性が強く阻害されることが知られている。
【００１０】
このため、ＰＣＲ法によるＤＮＡ増幅にあたり、被験物から細菌、ウィルス等（以下、遺伝子包含体）を分離し、さらに遺伝子包含体から核酸を抽出する操作が必要となる。分離・抽出方法としては、酵素、界面活性剤等により遺伝子包含体を分解し、その後にフェノール等を用いて、遺伝子包含体の分解物から核酸を抽出する方法が使用されている。また、核酸抽出の過程において、イオン交換樹脂、ガラスフィルター、ガラスビーズあるいはタンパク凝集作用を有する試薬等が使用される。
（【００１１】以降は省略されています）

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