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公開番号2025102588
公報種別公開特許公報(A)
公開日2025-07-08
出願番号2023220133
出願日2023-12-26
発明の名称改変型RNAポリメラーゼ
出願人東洋紡株式会社
代理人
主分類C12N 15/54 20060101AFI20250701BHJP(生化学;ビール;酒精;ぶどう酒;酢;微生物学;酵素学;突然変異または遺伝子工学)
要約【課題】熱安定性もしくは比活性が向上した改変型RNAポリメラーゼを提供することを課題とする。
【解決手段】所定の位置におけるアミノ酸を改変された改変型RNAポリメラーゼにより、上記の課題を解決する。
【選択図】なし
特許請求の範囲【請求項１】
配列番号１のアミノ酸配列と９０％以上の同一性を有し、配列番号１における１９７番目に相当する位置のアミノ酸が改変されているＲＮＡポリメラーゼ。
続きを表示（約 740 文字）【請求項２】
配列番号１のアミノ酸配列と９０％以上の同一性を有し、配列番号１における１９７番目に相当する位置のアミノ酸がアスパラギンに改変されているＲＮＡポリメラーゼ。
【請求項３】
請求項１または２に記載のＲＮＡポリメラーゼをコードするポリヌクレオチド。
【請求項４】
請求項１または２に記載のＲＮＡポリメラーゼをコードするポリヌクレオチドを含むベクター。
【請求項５】
請求項１または２に記載のＲＮＡポリメラーゼをコードするポリヌクレオチドを含むベクターを用いて形質転換された組換え宿主細胞。
【請求項６】
請求項１または２に記載のＲＮＡポリメラーゼをコードするポリヌクレオチド、前記ポリヌクレオチドを含むベクター、または前記ベクターを用いて形質転換された組換え宿主細胞を用いてＲＮＡポリメラーゼを製造する方法。
【請求項７】
請求項１または２に記載のＲＮＡポリメラーゼ、前記ＲＮＡポリメラーゼをコードするポリヌクレオチド、前記ポリヌクレオチドを含むベクター、または前記ベクターを用いて形質転換された組換え宿主細胞を含む試薬。
【請求項８】
請求項１または２に記載のＲＮＡポリメラーゼを用いてインビトロ転写反応を行う方法。
【請求項９】
インビトロ転写反応後のＲＮＡ量が、対応する野生型ＲＮＡポリメラーゼを使用してインビトロ転写反応を行った場合と比較して、１１０％以上である、請求項８に記載の方法。
【請求項１０】
請求項１または２に記載のＲＮＡポリメラーゼを用いてｍＲＮＡを合成する方法。
（【請求項１１】以降は省略されています）
発明の詳細な説明【技術分野】
【０００１】
本発明は、改変されたＲＮＡポリメラーゼに関する。より具体的には、本発明は、野生型と比較して、熱安定性もしくは比活性が向上した改変型ＲＮＡポリメラーゼおよび該ＲＮＡポリメラーゼの製造方法及びその用途に関する。
続きを表示（約 2,800 文字）【背景技術】
【０００２】
ＤＮＡ依存性ＲＮＡポリメラーゼはＤＮＡ中のプロモーター配列を認識しＤＮＡを鋳型としてＲＮＡを合成する酵素であり、生体内においてゲノムＤＮＡからｍＲＮＡを合成する転写反応を担うことから多くの研究が行われてきた。なかでもファージ由来のＲＮＡポリメラーゼは比較的単純な構造を持ち、単一のサブユニットで機能することから、古くから生化学的、構造生物学的な研究の対象となってきた。これらのＲＮＡポリメラーゼはインビトロ（ｉｎｖｉｔｒｏ）でＲＮＡを合成する用途においても汎用されており、これにより合成されたＲＮＡは、分子生物学的手法に用いるＲＮＡプローブや、様々な機能性ＲＮＡとして、あるいは細胞内でのタンパク質発現、もしくは無細胞タンパク合成系で使用する鋳型ＲＮＡとして利用されている。
【０００３】
また、ＲＮＡポリメラーゼの鋳型ＤＮＡから多数のＲＮＡを合成する性質を使用して、ＮＡＳＢＡ法、ＴＭＡ法といった等温増幅反応が開発されており、これらの手法は臨床診断に応用されている。
【０００４】
近年はＲＮＡポリメラーゼにより合成されるＲＮＡはｍＲＮＡワクチンをはじめとするｍＲＮＡ医薬にも応用されており、ＲＮＡポリメラーゼは医薬品製造の分野においても広く用いられている。特許文献１には熱安定性の向上した改変型のＴ７ＲＮＡポリメラーゼが記載されているが、さらに性能の向上したＲＮＡポリメラーゼが望まれている。
【先行技術文献】
【特許文献】
【０００５】
特許５８５１７０９号公報
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００６】
上述の通り、ＲＮＡポリメラーゼが使用される用途が広がる中で、ＲＮＡポリメラーゼの性能について更なる改良が望まれている。本発明者は、従来のＲＮＡポリメラーゼは、熱安定性や比活性が低いことを問題視していた。そこで、本発明は、従来のものよりも熱安定性もしくは比活性が高い改変型ＲＮＡポリメラーゼを提供することを課題とする。
【課題を解決するための手段】
【０００７】
本発明者らは、上記課題を解決するために鋭意検討を重ねた結果、野生型ＲＮＡポリメラーゼのアミノ酸配列において、所定の位置におけるアミノ酸を改変することで熱安定性の向上もしくは比活性の向上が達成されたＲＮＡポリメラーゼが得られることを見出し、本発明を完成するに至った。
【０００８】
すなわち、代表的な本願発明は、以下の通りである。
［項１］
配列番号１のアミノ酸配列と９０％以上の同一性を有し、配列番号１における１９７番目に相当する位置のアミノ酸が改変されているＲＮＡポリメラーゼ。
［項２］
配列番号１のアミノ酸配列と９０％以上の同一性を有し、配列番号１における１９７番目に相当する位置のアミノ酸がアスパラギンに改変されているＲＮＡポリメラーゼ。
［項３］
項１または２に記載のＲＮＡポリメラーゼをコードするポリヌクレオチド。
［項４］
項１または２に記載のＲＮＡポリメラーゼをコードするポリヌクレオチドを含むベクター。
［項５］
項１または２に記載のＲＮＡポリメラーゼをコードするポリヌクレオチドを含むベクターを用いて形質転換された組換え宿主細胞。
［項６］
項１または２に記載のＲＮＡポリメラーゼをコードするポリヌクレオチド、前記ポリヌクレオチドを含むベクター、または前記ベクターを用いて形質転換された組換え宿主細胞を用いてＲＮＡポリメラーゼを製造する方法。
［項７］
項１または２に記載のＲＮＡポリメラーゼ、前記ＲＮＡポリメラーゼをコードするポリヌクレオチド、前記ポリヌクレオチドを含むベクター、または前記ベクターを用いて形質転換された組換え宿主細胞を含む試薬。
［項８］
項１または２に記載のＲＮＡポリメラーゼを用いてインビトロ転写反応を行う方法。
［項９］
インビトロ転写反応後のＲＮＡ量が、対応する野生型ＲＮＡポリメラーゼを使用してインビトロ転写反応を行った場合と比較して、１１０％以上である、項８に記載の方法。
［項１０］
項１または２に記載のＲＮＡポリメラーゼを用いてｍＲＮＡを合成する方法。
［項１１］
ｍＲＮＡ量が、対応する野生型ＲＮＡポリメラーゼを使用してｍＲＮＡ合成を行った場合と比較して、１１０％以上である、項１０に記載の方法。
［項１２］
項１または２に記載のＲＮＡポリメラーゼを用いてノンコーディングＲＮＡを合成する方法。
［項１３］
ノンコーディングＲＮＡが、ｍｉｃｒｏＲＮＡ、ｓｉＲＮＡ、ｐｉＲＮＡ、ｒＲＮＡ、ｔＲＮＡ、ｓｎＲＮＡ、ｓｎｏＲＮＡ、ＳＬＲＮＡ、ＳＲＰＲＮＡ、ｍＲＮＡ－ｌｉｋｅノンコーディングＲＮＡ、オリゴヌクレオチドから選択される少なくとも１以上である、項１２に記載の方法。
［項１４］
項１または２に記載のＲＮＡポリメラーゼを用いて、遺伝子編集のためのガイドＲＮＡを合成する方法。
［項１５］
項１または２に記載のＲＮＡポリメラーゼを用いてＲＮＡ医薬を合成する方法。
［項１６］
項１または２に記載のＲＮＡポリメラーゼを用いて等温増幅反応を行う方法。
［項１７］
項１または２に記載のＲＮＡポリメラーゼを用いて遺伝子検査を行う方法。
［項１８］
項１または２に記載のＲＮＡポリメラーゼを用いてインビボでのタンパク質発現またはインビトロで無細胞タンパク質合成を行う方法。
【発明の効果】
【０００９】
本発明により提供される改変型ＲＮＡポリメラーゼは、野生型に比べて熱安定性もしくは比活性が向上しており、ＲＮＡ合成の際に従来の野生型ＲＮＡポリメラーゼよりも高収量を達成することが出来る。
【発明を実施するための形態】
【００１０】
以下、本発明の実施形態を示しつつ、本発明についてさらに詳説するが、本発明はこれらに限定されるものではない。
なお、本明細書中に記載された非特許文献及び特許文献の全てが、本明細書中において参考として援用され、その全体が明細書に組み込まれる。また、本明細書中の「～」は「以上、以下」を意味し、例えば明細書中で「Ｘ～Ｙ」と記載されていれば「Ｘ以上、Ｙ以下」を示す。本明細書中の「及び／又は」は、いずれか一方又は両方を意味する。本明細書中の「含む」は、「実質的にからなる」及び「のみからなる」という概念を包含する。
（【００１１】以降は省略されています）

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