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公開番号2025072877
公報種別公開特許公報(A)
公開日2025-05-12
出願番号2023183308
出願日2023-10-25
発明の名称非複製型牛伝染性リンパ腫ウイルス(BLV)ワクチン
出願人国立大学法人東京大学
代理人弁理士法人フィールズ国際特許事務所
主分類A61K 39/21 20060101AFI20250501BHJP(医学または獣医学;衛生学)
要約【課題】新規な非複製型牛伝染性リンパ腫ウイルス(BLV)ワクチンが提供される。
【解決手段】本発明によれば、pol遺伝子の機能の少なくとも一部が欠損した牛伝染性リンパ腫ウイルス(BLV)ワクチンが提供される。本発明によれば、免疫原性が高く、かつ、感染した対象において複製しない安全性の高いBLVワクチンを提供できる点で有利である。
【選択図】図1
特許請求の範囲【請求項１】
ｐｏｌ遺伝子の機能の少なくとも一部が欠損した牛伝染性リンパ腫ウイルス（ＢＬＶ）を含む、ＢＬＶワクチン。
続きを表示（約 270 文字）【請求項２】
接種回数が２回以上であり、かつ、接種間隔が１週以上である、請求項１に記載のＢＬＶワクチン。
【請求項３】
非複製型牛伝染性リンパ腫ウイルス（ＢＬＶ）産生細胞を培養する工程を含む、ＢＬＶワクチンの製造方法であって、非複製型ＢＬＶ産生細胞がｐｏｌ遺伝子の機能の少なくとも一部が欠損した牛伝染性リンパ腫ウイルス（ＢＬＶ）の遺伝子を含んでなるものである、製造方法。
【請求項４】
請求項１または２に記載のワクチンを対象に接種する工程を含む、ＢＬＶの予防方法または治療方法（但し、対象からヒトを除く）。

発明の詳細な説明【技術分野】
【０００１】
本発明は、非複製型牛伝染性リンパ腫ウイルス（ＢＬＶ）ワクチンに関する。
続きを表示（約 4,800 文字）【背景技術】
【０００２】
牛伝染性リンパ腫ウイルス（ＢＬＶ）は、悪性Ｂリンパ腫である地方病性牛伝染性リンパ腫（ＥＢＬ）の原因ウイルスであり、宿主細胞のＤＮＡにプロウイルスとして組み込まれるレトロウイルスである。ＢＬＶ感染牛の約７割は未発症健康、約３割は持続的リンパ球増多症であり、長年の潜伏期間を経て約数％が牛伝染性リンパ腫を発症する（非特許文献１および２）。
【０００３】
近年、ＥＢＬは増加し続けているが、ＥＢＬに対する予防効果のあるワクチンの開発には至っていない。その主な要因の一つとして、ＢＬＶ感染細胞からのウイルス産生量が同じレトロウイルス科に属するエイズウイルスの約１０００から１００００分の１と極めて少なく、不活化ワクチンや細胞由来ワクチンの開発が困難であったことが挙げられる。これまでに、ＢＬＶの産生量を高めるための発現ベクターの開発等が試みられてきたが（特許文献１）、レトロウイルスであるＢＬＶは感染後、宿主のゲノムにウイルス遺伝子が組み込まれるリスクがあるため、生ワクチンの実用化における問題が依然として残されていた。
【先行技術文献】
【特許文献】
【０００４】
特開２０１９－２４３５１号公報
【非特許文献】
【０００５】
Gillet NA, et al., Retrovirology, 2007, 4: 18.
Aida Y, et al., Frontiers in Microbiology, 2013, 4: 328.
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００６】
本発明は、新規な非複製型牛伝染性リンパ腫ウイルス（ＢＬＶ）ワクチンの提供を目的とする。
【課題を解決するための手段】
【０００７】
本発明者らは今般、感染能を有し、かつ、複製能を失った牛伝染性リンパ腫ウイルス（ＢＬＶ）を産生する、ウイルス産生細胞株の樹立に成功し、該細胞株が産生するウイルスの遺伝子配列を解析した結果、ｐｏｌ遺伝子の一部が欠失していることを見出した。本発明者らはまた、該ウイルスの接種によりマウスおよびウシにおいて抗体産生が誘導されることを見出すとともに、当該マウスおよびウシから採取した血清のＢＬＶに対する中和抗体価が経時的に上昇することを見出した。本発明はこれらの知見に基づくものである。
【０００８】
本発明によれば以下の発明が提供される。
［１］ｐｏｌ遺伝子の機能の少なくとも一部が欠損した牛伝染性リンパ腫ウイルス（ＢＬＶ）を含む、ＢＬＶワクチン。
［２］接種回数が２回以上であり、かつ、接種間隔が１週以上である、上記［１］に記載のＢＬＶワクチン。
［３］非複製型牛伝染性リンパ腫ウイルス（ＢＬＶ）産生細胞を培養する工程を含む、ＢＬＶワクチンの製造方法であって、非複製型ＢＬＶ産生細胞がｐｏｌ遺伝子の機能の少なくとも一部が欠損した牛伝染性リンパ腫ウイルス（ＢＬＶ）の遺伝子を含んでなるものである、製造方法。
［４］上記［１］または［２］に記載のワクチンを対象に接種する工程を含む、ＢＬＶの予防方法または治療方法（但し、対象からヒトを除く）。
【０００９】
本発明によれば、免疫原性が高く、かつ、感染した対象では複製しない安全性の高い牛伝染性リンパ腫ウイルス（ＢＬＶ）ワクチンを提供できる点で有利である。
【図面の簡単な説明】
【００１０】
図１は、野生型ＢＬＶの遺伝子構成を示すとともに、ＣＭＶΔＵ３－ｐＢＬＶ－４１６ΔＲＴプラスミド（ｐＢＬＶ－４１６ΔＲＴ）のｐｏｌ遺伝子の欠失部分をＣＭＶΔＵ３－ｐＢＬＶ－４１６プラスミド（ｐＢＬＶ－４１６）との対比において示す。
図２Ａは、ｐＢＬＶ－４１６ΔＲＴおよびｐＢＬＶ－４１６のｐｏｌ遺伝子領域をＰＣＲで増幅した結果をそれぞれ示す。なお、陰性対照には空ベクターであるｐＢｌｕｅｓｃｒｉｐｔＩＩＫＳ（－）プラスミドを使用し、陽性対照にはＢＬＶ持続感染細胞であるＦＬＫ－ＢＬＶ細胞を使用した。図２Ｂは、ｐＢＬＶ－４１６ΔＲＴ導入細胞およびｐＢＬＶ－４１６導入細胞により産生されるウイルスタンパク質の発現について、ＢＬＶ感染牛血清（左）およびＢＬＶ非感染牛血清（右）を用いたウエスタンブロットの結果をそれぞれ示す。なお、陰性対照には空ベクターであるｐＢｌｕｅｓｃｒｉｐｔＩＩＫＳ（－）プラスミドを導入した細胞を使用し、陽性対照にはＢＬＶ持続感染細胞であるＦＬＫ－ＢＬＶ細胞を使用した。
図３は、ｐＢＬＶ－４１６ΔＲＴ導入細胞およびｐＢＬＶ－４１６導入細胞におけるウイルスタンパク質の細胞内局在について、免疫蛍光抗体法の結果をそれぞれ示す。なお、陰性対照には空ベクターであるｐＢｌｕｅｓｃｒｉｐｔＩＩＫＳ（－）プラスミドを導入した細胞を使用し、陽性対照にはＢＬＶ持続感染細胞であるＦＬＫ－ＢＬＶ細胞を使用した。
図４は、ｐＢＬＶ－４１６ΔＲＴ導入細胞およびｐＢＬＶ－４１６導入細胞におけるウイルスタンパク質の発現量について、ウエスタンブロットの結果をそれぞれ示す。なお、陰性対照には空ベクターであるｐＢｌｕｅｓｃｒｉｐｔＩＩＫＳ（－）プラスミドを導入した細胞を使用し、陽性対照にはＢＬＶ持続感染細胞であるＦＬＫ－ＢＬＶ細胞を使用した。スチューデントのｔ検定の結果、
＊
はｐ＜０．０５、
＊＊
はｐ＜０．０１をそれぞれ示す。
図５は、ｐＢＬＶ－４１６ΔＲＴ導入細胞およびｐＢＬＶ－４１６導入細胞におけるシンシチウム形成能の結果をそれぞれ示す。なお、陰性対照には空ベクターであるｐＢｌｕｅｓｃｒｉｐｔＩＩＫＳ（－）プラスミドを導入した細胞を使用した。スチューデントのｔ検定の結果、
＊＊
はｐ＜０．０１、
＊＊＊
はｐ＜０．００１をそれぞれ示す。
図６は、ｐＢＬＶ－４１６ΔＲＴ導入細胞およびｐＢＬＶ－４１６導入細胞における細胞間感染能の結果をそれぞれ示す。なお、陰性対照には空ベクターであるｐＢｌｕｅｓｃｒｉｐｔＩＩＫＳ（－）プラスミドを導入した細胞を使用し、陽性対照にはＢＬＶ持続感染細胞であるＦＬＫ－ＢＬＶ細胞を使用した。
図７Ａは、ｐＢＬＶ－４１６ΔＲＴ導入細胞およびｐＢＬＶ－４１６導入細胞により産生されたウイルスタンパク質の放出量をそれぞれ示す。図７Ｂは、ｐＢＬＶ－４１６ΔＲＴ導入細胞およびｐＢＬＶ－４１６導入細胞により産生されたウイルスタンパク質の逆転写酵素活性をそれぞれ示す。図７Ｃは、ｐＢＬＶ－４１６ΔＲＴ導入細胞およびｐＢＬＶ－４１６導入細胞におけるシンシチウム形成能の結果をそれぞれ示す。図７Ｄは、ｐＢＬＶ－４１６ΔＲＴ導入細胞およびｐＢＬＶ－４１６導入細胞から放出されたウイルスタンパク質について、ウエスタンブロットの結果をそれぞれ示す。なお、陰性対照には空ベクターであるｐＢｌｕｅｓｃｒｉｐｔＩＩＫＳ（－）プラスミドを導入した細胞を使用し、陽性対照にはＢＬＶ持続感染細胞であるＦＬＫ－ＢＬＶ細胞を使用した。スチューデントのｔ検定の結果、
＊＊＊
はｐ＜０．００１を示す。
図８は、野生型ＢＬＶの遺伝子構成を示すとともに、ＣＭＶΔＵ３－ｐＢＬＶ－ＩＦΔＲＴプラスミド（ｐＢＬＶ－ＩＦΔＲＴ）のｐｏｌ遺伝子の欠失部分をＣＭＶΔＵ３－ｐＢＬＶ－ＩＦプラスミド（ｐＢＬＶ－ＩＦ）との対比において示す。
図９Ａは、ｐＢＬＶ－ＩＦΔＲＴ導入細胞およびｐＢＬＶ－ＩＦ導入細胞におけるウイルスタンパク質の発現量について、ウエスタンブロットの結果をそれぞれ示す。図９Ｂは、ｐＢＬＶ－ＩＦΔＲＴ導入細胞およびｐＢＬＶ－ＩＦ導入細胞におけるシンシチウム形成能の結果をそれぞれ示す。図９Ｃは、ｐＢＬＶ－ＩＦΔＲＴ導入細胞およびｐＢＬＶ－ＩＦ導入細胞の培養上清中のウイルス量をＣａｐｔｕｒｅＥＬＩＳＡで測定した結果をそれぞれ示す。なお、陰性対照には空ベクターであるｐＢｌｕｅｓｃｒｉｐｔＩＩＫＳ（－）プラスミドを導入した細胞を使用し、陽性対照にはＢＬＶ持続感染細胞であるＦＬＫ－ＢＬＶ細胞を使用した。スチューデントのｔ検定の結果、
＊
はｐ＜０．０５、
＊＊
はｐ＜０．０１、
＊＊＊
はｐ＜０．００１をそれぞれ示す。
図１０Ａは、ｐＢＬＶ－４１６ΔＲＴ導入細胞およびｐＢＬＶ－４１６導入細胞により産生されたウイルスタンパク質をマウスに接種した実験のスケジュールを示す。図１０Ｂは、接種後３週目の血液細胞中のＢＬＶ遺伝子について、ＮｅｓｔｅｄＰＣＲ法の結果を示す。図１０Ｃは、マウスから摘出した脾臓細胞とＣＣ８１－ＧＲＥＭＧ細胞を共培養した結果を示す。図１０Ｄは、接種後０～６週目までの抗ｐ２４抗体をＥＬＩＳＡにより定量した結果を示す。陰性対照にはＰＢＳを使用し、陽性対照にはＢＬＶ持続感染細胞であるＦＬＫ－ＢＬＶ細胞を使用した。スチューデントのｔ検定の結果、
＊
はｐ＜０．０５を示す。
図１１は、野生型ＢＬＶの遺伝子構成を示すとともに、ＰＫ１５－ＢＬＶΔＲＴ細胞株中のＢＬＶのｐｏｌ遺伝子の欠失部分をＣＭＶΔＵ３－ｐＢＬＶ－４１６プラスミド（ｐＢＬＶ－４１６）との対比において示す。
図１２は、ＰＫ１５－ＢＬＶΔＲＴ細胞株におけるウイルスタンパク質の発現量について、ウエスタンブロットの結果を示す。なお、陽性対照にはＢＬＶ持続感染細胞であるＦＬＫ－ＢＬＶ細胞を使用した。
図１３は、ＰＫ１５－ＢＬＶΔＲＴ細胞株におけるウイルスタンパク質の細胞内局在について、免疫蛍光抗体法の結果を示す。なお、陽性対照にはＢＬＶ持続感染細胞であるＦＬＫ－ＢＬＶ細胞を使用した。
図１４Ａは、ＰＫ１５－ＢＬＶΔＲＴ細胞株により産生されたウイルスタンパク質の放出量を示す。図１４Ｂは、Ｈｉｓ－ｐ２４抗原を標準として作成した標準曲線を示す。
図１５は、ＰＫ１５－ＢＬＶΔＲＴ細胞株により産生されたウイルスを接種したマウス（ＰＫ１５－ＢＬＶΔＲＴ）および陰性対照としてＰＢＳを接種したマウス（ＰＢＳ）における抗ｐ２４抗体の産生量の推移をそれぞれ示す（各群ｎ＝５）。なお、エラーバーは標準偏差を示す。
図１６は、ＰＫ１５－ＢＬＶΔＲＴ細胞株により産生されたウイルスを接種したマウスから採取した血清（０週、３週、６週）の中和抗体価を示す。
図１７は、ＰＫ１５－ＢＬＶΔＲＴ細胞株により産生されたウイルスを接種したウシにおける抗ｐ２４抗体の産生量の推移を示す。
図１８は、ＰＫ１５－ＢＬＶΔＲＴ細胞株により産生されたウイルスを接種したウシにおける抗ｇｐ５１抗体の産生量の推移を示す。
図１９は、ＰＫ１５－ＢＬＶΔＲＴ細胞株により産生されたウイルスを接種したウシにおけるプロウイルス量の推移を示す。
図２０は、ＰＫ１５－ＢＬＶΔＲＴ細胞株により産生されたウイルスを接種したウシにおけるリンパ数の推移を示す。
図２１は、ＰＫ１５－ＢＬＶΔＲＴ細胞株により産生されたウイルスを接種したウシから採取した血清（０週、３週、６週）の中和抗体価を示す。
【発明の具体的説明】
（【００１１】以降は省略されています）

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