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公開番号2025113401
公報種別公開特許公報(A)
公開日2025-08-01
出願番号2025085496,2021544180
出願日2025-05-22,2020-01-29
発明の名称核酸を合成するための再使用可能な開始剤
出願人モレキュラーアッセンブリーズ, インコーポレイテッド
代理人個人,個人,個人,個人,個人
主分類C12P 19/34 20060101AFI20250725BHJP(生化学;ビール;酒精;ぶどう酒;酢;微生物学;酵素学;突然変異または遺伝子工学)
要約【課題】固体支持体にカップリングされた再生可能な開始剤を使用して、ポリヌクレオチド(例えば、DNAおよびRNA)を合成するための改善された方法を提供すること。
【解決手段】本発明の方法を使用すると、特定のポリヌクレオチド配列が、水性環境において、核酸鋳型を使用することなく、1塩基ずつデノボ合成され得る。本発明は、核酸合成のための改善された方法を提供する。本発明の方法は、より迅速でより長いポリヌクレオチドのデノボ合成を提供する。
【選択図】なし
特許請求の範囲【請求項１】
明細書に記載の発明。

発明の詳細な説明【技術分野】
【０００１】
関連出願
本出願は、２０１９年１月２９日出願の米国特許出願第１６／２６１，２２９号（その内容は、その全体において本明細書に参考として援用される）の利益および優先権を主張する。
続きを表示（約 3,100 文字）【０００２】
発明の分野
本発明は、所望の配列を有するポリヌクレオチドを、鋳型の必要性なしに合成するための方法および装置に関する。
【背景技術】
【０００３】
背景
大部分のデノボ核酸配列決定は、十分に確立された固相ホスホルアミダイト技術を使用して行われる。そのホスホルアミダイト技術は、天然の（または非天然の）核酸塩基に相当するホスホルアミダイト試薬から構築された配列の逐次的な脱保護および合成を要する。しかし、ホスホルアミダイト核酸合成は、長さが２００塩基対（ｂｐ）より大きい核酸が、高い破損率および副反応を経験するという点において、長さに制限がある。さらに、ホスホルアミダイト合成は、毒性の副生成物を生じ、この廃棄物の処理は、核酸合成機の利用可能性を制限し、請負のオリゴヌクレオチド生成のコストを増大させる（オリゴヌクレオチド合成の年間需要は、３００，０００ガロン超の危険な化学廃棄物（アセトニトリル、トリクロロ酢酸、トルエン、テトラヒドロフラン、およびピリジンが挙げられる）の原因であると予測される）。ＬｅＰｒｏｕｓｔら，ＮｕｃｌｅｉｃＡｃｉｄｓＲｅｓ．，ｖｏｌ．３８（８），ｐ．２５２２－２５４０，（２０１０）（その全体において本明細書中に参考として援用される）を参照のこと。従って、オリゴヌクレオチド合成のより効率的かつ費用効果的な方法の必要性がある。
【先行技術文献】
【非特許文献】
【０００４】
ＬｅＰｒｏｕｓｔら，ＮｕｃｌｅｉｃＡｃｉｄｓＲｅｓ．（２０１０）ｖｏｌ．３８（８）ｐ．２５２２～２５４０
【発明の概要】
【課題を解決するための手段】
【０００５】
要旨
本発明は、核酸合成のための改善された方法を提供する。本発明の方法は、より迅速でより長いポリヌクレオチドのデノボ合成を提供する。よって、本発明は、特注の核酸合成の全体のコストを劇的に低減する。本発明の方法は、ヌクレオチジルトランスフェラーゼ酵素を使用して、切断可能なリンカーによってインヒビターにカップリングされたヌクレオチドアナログを組み込むことによる、ポリヌクレオチドの鋳型非依存性合成に関する。上記インヒビターが原因で、合成は、各々新たな塩基の付加に伴って一旦停止し、その際に上記リンカーが切断され、上記インヒビターを分離し、天然に存在する（すなわち、さらなるヌクレオチド組み込みのための基質として、上記酵素によって認識される）ヌクレオチドと本質的に同一のポリヌクレオチドを残す。
特に、本発明は、鋳型非依存性核酸合成のための再生可能な基質を提供する。デノボ合成は、固体支持体に結合された核酸開始剤で開始する。適切な酵素（例えば、ポリメラーゼ、例えば、末端デオキシヌクレオチジルトランスフェラーゼ（ＴｄＴ））の存在下で、ヌクレオチドアナログは、オリゴヌクレオチドを作るために、上記核酸開始剤に付加される。上記ヌクレオチドアナログが、酵素による付加を、１ヌクレオチドの付加後に停止させる除去可能な終結基を含むことは、好ましい。除去可能な終結基は、上記核酸の塩基部分に、および／または上記核酸の３’ヒドロキシルに連結され得る。上記終結基および／または上記３’ブロッキング基の脱ブロックは、上記酵素の基質である新たな活性部位を作る。新たなヌクレオチドまたはヌクレオチドアナログの付加に続いて、上記オリゴヌクレオチドは伸長される。
【０００６】
いくつかの場合において、上記核酸開始剤は、上記酵素の基質である３’部分を含む。放出剤は、上記３’部分を脱カップリングし、それによって、上記オリゴヌクレオチドを放出するために使用される、上記３’部分、上記核酸開始剤、および上記固体支持体は、新生オリゴヌクレオチドの放出後に再使用可能である。
【０００７】
本発明はさらに、特注のポリヌクレオチドの生成のために本発明の方法を利用する装置を含む。本発明の装置は、水性条件およびヌクレオチドアナログの複数の供給源を提供する１またはこれより多くのバイオリアクターを含む。上記バイオリアクターは、例えば、レザバ、フローセル、またはマルチウェルプレートであり得る。上記バイオリアクターは、核酸開始剤および切断可能な３’部分を有する固体支持体を含み得る。上記固体支持体から出発して、上記ポリヌクレオチドは、ヌクレオチジルトランスフェラーゼ、例えば、末端デオキシヌクレオチジルトランスフェラーゼ（ＴｄＴ）、または鋳型の指示なしにＤＮＡもしくはＲＮＡ鎖を伸長する任意の他の酵素の天然の活性を通じて、連続してヌクレオチドを付加することによって、上記リアクターの中で成長する。上記リンカーの切断の際に、天然のポリヌクレオチドは、上記固体支持体から放出される。上記配列が一旦完了すると、上記支持体は切断して除去されるか、または上記３’部分は、放出剤と接触され、天然において見出されるものに本質的に等しいポリヌクレオチドを残す。いくつかの実施形態において、上記装置は、ヌクレオチド付加後にヌクレオチドアナログ溶液を回収し、その後のヌクレオチド付加のためにそのヌクレオチドアナログ溶液を再使用することによって、そのヌクレオチドアナログ溶液をリサイクルするように設計される。従って、廃棄物の生成が少ないほど、１塩基あたりの全体のコストは、技術水準の方法と比較して低減される。ある特定の実施形態において、バイオリアクターは、微小流体デバイスを含み得る、および／またはインクジェット印刷技術を使用し得る。
【０００８】
終結基は、例えば、荷電部分または立体化学的インヒビターを含み得る。一般に、ヌクレオチジルトランスフェラーゼ酵素が機能的コンホメーションに達しないようにする大きな高分子は、オリゴヌクレオチド合成を阻害するために有用である、このような高分子としては、ポリマー、ポリペプチド、ポリペプトイド、およびナノ粒子が挙げられる。上記高分子は、ヌクレオチジルトランスフェラーゼの活性部位へのアクセスを物理的にブロックするために十分大きくあるべきであるが、反応動態を負に変化させるほど大きくはない。上記高分子は、以下で記載されるように、種々のリンカーのうちのいずれかを使用して、ヌクレオチドアナログに連結される。
【０００９】
３’－Ｏ－ブロックしたヌクレオチドアナログを使用する実施形態において、上記３’－Ｏ－ブロッキング基は、代表的には、小さくかつ容易に除去され、従って、改変された活性部位を有する操作された酵素に伴う使用を可能にする。例えば、上記３’－Ｏ－ブロッキング基は、アジドメチル、アミノ、またはアリル基を含み得る。
【００１０】
いくつかの実施形態において、オリゴヌクレオチド合成は、各ヌクレオチドアナログを付加した後であるが、終結基を切断する前に、１またはこれより多くの合成したオリゴヌクレオチドへの３’エキソヌクレアーゼの導入を含み得る。上記終結基は、３’エキソヌクレアーゼが、ヌクレオチドアナログが付加された任意のオリゴヌクレオチドに対して作用するのをブロックすると同時に、ターミネーターを含むアナログを成功裡に付加しなかったオリゴヌクレオチドは、３’エキソヌクレアーゼによって除去される。この様式において、本発明は、プロセス内品質管理を可能にし、合成後精製の必要性を排除し得る。
（【００１１】以降は省略されています）

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