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公開番号2025116476
公報種別公開特許公報(A)
公開日2025-08-08
出願番号2024010920
出願日2024-01-29
発明の名称配座固定アミロイドβ42誘導体
出願人国立大学法人京都大学,国立大学法人滋賀医科大学
代理人個人
主分類C07K 14/47 20060101AFI20250801BHJP(有機化学)
要約【課題】ヒトの野生型アミロイドβ42と同じ毒性ターン構造を特異的に認識する抗体の開発や、超早期アルツハイマー病の迅速診断用試薬、毒性配座を有するアミロイドβ42に結合してその毒性を緩和する化合物、抗体医薬の開発に用いることができるアミロイドβ42誘導体を提供する。
【解決手段】28位のアミノ酸残基と42位のアミノ酸残基が架橋され、22位のグルタミン酸残基と23位のアスパラギン酸残基においてアミノ酸配列によるβシート構造間のターン構造が固定された立体構造を有し、28位と42位以外のアミノ酸配列が、野生型アミロイドβ42と同じアミノ酸配列を有する配座固定アミロイドβ42誘導体を設計、合成したところ、極めて高い神経細胞毒性と、即時且つ持続的にβシート構造形成及び凝集能を有する誘導体が得られた。
【選択図】図4
特許請求の範囲【請求項１】
アミノ酸４２残基のアミロイドβ４２において、
２８位のアミノ酸残基と４２位のアミノ酸残基が架橋され、βシート形成領域間に存在する２２位のグルタミン酸残基と２３位のアスパラギン酸残基からなるターン構造が固定された立体配座を有し、前記２８位と前記４２位のアミノ酸残基を除く全てのアミノ酸配列が、野生型アミロイドβ４２と同じアミノ酸配列を有することを特徴とする配座固定アミロイドβ４２誘導体。
続きを表示（約 490 文字）【請求項２】
２８位のリシン残基がシステイン残基又はホモシステイン残基に置換され、４２位のアラニン残基がシステイン残基又はホモシステイン残基に置換され、２８位と４２位のアミノ酸残基間で分子内ジスルフィド結合を形成することにより、前記ターン構造が固定された請求項１に記載の配座固定アミロイドβ４２誘導体。
【請求項３】
２８位のリシン残基がホモシステイン残基に置換され、４２位のアラニン残基がシステイン残基に置換された請求項２に記載の配座固定アミロイドβ４２誘導体。
【請求項４】
２８位のリシン残基がシステイン残基に置換され、４２位のアラニン残基がホモシステイン残基に置換された請求項２に記載の配座固定アミロイドβ４２誘導体。
【請求項５】
２８位のリシン残基及び４２位のアラニン残基が共にシステイン残基に置換された請求項２に記載の配座固定アミロイドβ４２誘導体。
【請求項６】
２８位のリシン残基及び４２位のアラニン残基が共にホモシステイン残基に置換された請求項２に記載の配座固定アミロイドβ４２誘導体。

発明の詳細な説明【技術分野】
【０００１】
本発明は、野生型のアミロイドβ４２ペプチドの配列において毒性ターン構造を維持するように分子内で架橋し固定したアミロイドβ４２の誘導体に関するものである。
続きを表示（約 5,400 文字）【背景技術】
【０００２】
アルツハイマー病（Alzheimer's disease：以下、「ＡＤ」という）は、神経変性疾患の一種であるが、現状では未だ有効な治療方法がほとんどなく、ＡＤの発症機構の解明並びに根本的治療法の確立が強く望まれている。近年、ＡＤの発症において、老人斑に蓄積するアミロイドβタンパク質（以下、「Ａβ」という）が重要な役割を果たしており、その凝集により神経細胞毒性を示すことが判明してきている。ＡＤでは、主に４０残基または４２残基のアミノ酸からなるＡβ（以下、それぞれ、「Ａβ４０」と「Ａβ４２」という。）が蓄積することが特徴であり、ＡＤの病因となることが見いだされているが、ＡＤの発症においては、Ａβ４２がその凝集性や神経毒性の高さから、Ａβ４０よりも重要な役割を担っていると考えられている。しかしながら、抗Ａβ抗体や抗タウ抗体等のＡＤの治療薬はこれまでのところ成功例がほとんどなく、現在のところでは、進行を遅らせる医薬品（アリセプト、メマリー等）が承認されているのみである。このことについては、病気が進行してから治療を開始していることが失敗の原因である可能性があり、早期に診断を行い、適切な治療を開始できれば、ＡＤを治療できる可能性があると考えられる。当初は、老人斑（Ａβ凝集体）周辺の神経細胞が死滅していることなどから、Ａβ凝集体を除去することがＡＤ治療に有効と考えられていたが、老人斑（Ａβ凝集体）の量とＡＤ病態があまり相関しないことから、Ａβ凝集体ではなく、準安定なＡβオリゴマーが毒性本体であると考えられるようになってきた。ここで、「準安定」であるとは、質量分析等によりＡβオリゴマーの構造を確認することができる時間、あるいは細胞を用いた試験においてＡβオリゴマーの毒性を評価することができる時間として、例えば２４時間程度はその状態で存在できることを意味している。ところが、数多くのＡβオリゴマー種のうち、どれが細胞毒性に関わっているのか、またそれらがどのような高次構造をとっているのかについては、ほとんど明らかになっていない。さらに、これらのＡβオリゴマーは、モノマーとアミロイド線維（フィブリル）との平衡状態にあり、純粋なオリゴマーを単離・構造決定することは不可能である。
【０００３】
Ａβのオリゴマー種の一部は、ＡＤ発症の初期段階でシナプス毒性を示すとともに、最終的に神経細胞の脱落をもたらすタウタンパク質の過剰リン酸化を誘発するために特に重要であると考えられている。本発明者の入江らはこれまでに、Ａβ４２の系統的なプロリン置換法、固体ＮＭＲ法、電子スピン共鳴法などによる解析から、アミノ酸配列の中央部分［２２位のグルタミン酸残基（Ｅ２２）及び２３位のアスパラギン酸残基（Ｄ２３）の近傍］でのβシート構造間のターン構造（細胞毒性発現の原因となることから以下、「毒性ターン構造」とも称する。図１左上）とＣ末端の疎水性コア（図１右上）を特徴とした２量体及び３量体（図１下）のモデルを提唱している。すなわち、Ａβのオリゴマー種のうち、毒性ターン構造をもつものや、一定以上の分子量（例えば、２０量体以上）をもつものが、毒性発現に必要であると考えている（ACS Chem. Neurosci. 2017, 8 (4), 807-816）。さらに入江らは、特にＡβ４２の分子間βシート構造間の中央部分（２２位及び２３位の近傍）で折れ曲がることにより毒性オリゴマーを形成する（図１右下）という「毒性配座理論」（非特許文献１）を提唱している。ここで、「毒性」とは、細胞に対する増殖抑制活性があること、細胞が死滅すること、長期増強（ＬＴＰ）の抑制（シナプス毒性又は神経毒性）があること等を意味する。ヒトの野生型Ａβ４２（ＷＴ－Ａβ４２）のアミノ酸配列は配列表の配列番号１及び図１に示した通りである。
【０００４】
毒性配座理論では、Ａβ４２の中央部分でのターン構造（特に、２２位及び２３位のアミノ酸残基を中心とした２０位から２５位のアミノ酸配列により構成される）の形成は、銅イオン等との反応によって生じた１０位のチロシン残基（Ｙ１０）のフェノキシラジカルによる３５位のメチオニン残基（Ｍ３５）の硫黄原子の酸化を効率的に促進し、生じたカチオンラジカルをＣ末端のカルボキシラートアニオンにより安定化できるものと理解できる。その結果、電荷を失ったＡβ４２のＣ末端コアの疎水性が増大して凝集しやすくなり、２量体及び３量体のオリゴマーが形成される。一方で、Ａβ４２のＣ末端の中性ラジカルはオリゴマー内に存在することから、長期間に亘って酸化ストレスを細胞に与えることが可能となるものと考えられる。Ａβ４２は２５位のグリシン残基（Ｇ２５）と２６位のセリン残基（Ｓ２６）でもターン構造を形成する（図１右上）が、２２位（Ｅ２２）と２３位（Ｄ２３）におけるターン構造を形成したＡβ４２よりも遙かに毒性が低いことが判明しているため、細胞毒性には２２位と２３位における毒性ターン構造が大きく関与していると考えられる。毒性ターン構造では、Ｅ２２及びＤ２３のカルボキシ基が共に主鎖に対して外側を向く（シス配置）を取っている。このような研究を通じて、入江らは、Ａβ４２の凝集と神経細胞毒性の発現において鍵となるＡβ４２の構造因子を明らかにすることによって、有害と考えられる立体配座に固定されたＡβ４２の誘導体を開発してきている（特許文献１参照）。
【０００５】
入江らはこれまでに、Ａβ４２のＥ２２をプロリン置換した９残基目から３５残基目からなるＡβペプチド（Ｅ２２Ｐ－Ａβ９－３５）をキャリアータンパク質と結合した誘導体を作製し、それを抗原として立体構造特異抗体である２４Ｂ３抗体（「ＩＢＬ－１０２抗体」ともいう。）を開発している。２４Ｂ３抗体は、開発時には、毒性ターン構造を有するＡβ４２を特異的に認識すると考えられた抗アミロイドβモノクローナル抗体である（特許文献２参照）。２４Ｂ３抗体は、Ｅ２２Ｐ－Ａβ及びその２量体モデルには強く結合するが、毒性ターン構造をあまりとっていないＷＴ－Ａβ４２モノマーに対する結合能が低いモノクローナル抗体であり、ヒト脳髄液を用いたＡＤ診断において一定の成功を収めている（非特許文献１、非特許文献２参照）。２４Ｂ３抗体と既存のＮ末端抗体とのサンドイッチＥＬＩＳＡ法を入江らと免疫生物学研究所とにより共同開発し、京都府立医科大学の徳田隆彦教授（現量子科学技術研究開発機構）の協力によりＡＤ患者の脳脊髄液を解析した結果、ＡＤ患者において毒性コンホマー量（毒性ターンをもつＡβ分子種の量）の全Ａβ４２量に対する割合が、ＡＤでない人と比べて有意に高いことが判明している。また、特発性正常圧水頭症患者においてもこの割合が高い傾向にあることが判明するとともに、ＡＤへの移行を判断する一つの指標になり得ることが示唆された（順天堂大学・中島円准教授との共同研究）。さらに２４Ｂ３抗体は、Ａβ４２の神経細胞毒性を数種の市販抗体よりも強く抑制したことから、入江らは千葉大学医学研究科と共同で、ＡＤモデルマウス（Ｔｇ２５７６）に対する治療効果を検討した結果、高架式十字迷路並びに巣作り試験において、認知機能改善効果が認められた。２４Ｂ３抗体を用いたサンドイッチＥＬＩＳＡは、２０１６年１１月に、免疫生物学研究所より研究用試薬として販売され、国内外で多くの研究者に使用されている。
【０００６】
その後のＸ線共結晶構造解析の結果、２４Ｂ３抗体は、上述のとおり毒性ターン構造をもつと考えられたＥ２２Ｐ－Ａβ誘導体及びその２量体モデルを特異的に認識して結合することが分かったが、生体内におけるＷＴ－Ａβ４２の毒性ターン構造に対する結合様式はまったく不明なままである。これは、ヒト脳内には存在しないプロリン置換体であるＥ２２Ｐ－Ａβ誘導体を抗原（ハプテン）として用いていることも一因である。このことから、ＡＤ診断、特に超早期の診断により有用な抗体を開発するためには、抗原として、毒性ターンの位置でのプロリン置換または２２位及び２３位側鎖間のラクタム形成を行うことなく、毒性ターンの位置でＷＴ－Ａβ４２のアミノ酸配列をもつＡβ４２誘導体を開発することが望ましいと考えられた。
【０００７】
それに続く研究において、入江らは、Ｅ２２とＤ２３を中心として２箇所をシステイン残基（Ｃ）で置換した誘導体を系統的に合成したのち，それぞれをＤＭＳＯ酸化して分子内でジスルフィド（Ｓ－Ｓ）結合を形成させた。その結果、１７位のロイシン残基（Ｌ１７）と２８位のリシン残基（Ｋ２８）を共にシステイン残基に置換して分子内Ｓ－Ｓ結合を形成させた架橋構造を持つＡβ４２誘導体［L17C,K28C-17,28-S-S-Amyloid-β42、以下、「１７，２８－ＳＳ－Ａβ４２（Ｃ－Ｃ）」（配列番号２）と表記する］を開発した。以下、分子内Ｓ－Ｓ結合により毒性ターン構造を固定した架橋構造を有するＡβ４２誘導体を、「ＳＳ－Ａβ４２」と表記する。この１７，２８－ＳＳ－Ａβ４２（Ｃ－Ｃ）は生体内で毒性を示すと考えられるＷＴ－Ａβ４２の毒性ターン構造を形成するＥ２２及びＤ２３とその前後各４残基（１８位～２７位）がＷＴ－Ａβ４２のアミノ酸配列と同じであって、特にＥ２２が生体内に存在しないプロリン置換されておらず、またＥ２２及びＤ２３の側鎖間にラクタムを構築することなく毒性ターンの立体構造が安定的に固定されたものである。１７，２８－ＳＳ－Ａβ４２（Ｃ－Ｃ）［１７，２８－ＳＳ－Ａβ４２］は、それまで高い凝集性を示し最も神経細胞毒性が高かったＥ２２Ｐ－Ａβ４２と同等以上の凝集性と神経細胞毒性を示すものであることが分かった（特許文献３、非特許文献３参照）。また、１７，２８－ＳＳ－Ａβ（Ｃ－Ｃ）以外の誘導体として、Ｌ１７をホモシステイン残基に置換しＫ２８をシステイン残基に置換して分子内Ｓ－Ｓ結合を形成させた誘導体［１７，２８－ＳＳ－Ａβ（ｈＣ－Ｃ）］や、Ｌ１７をシステイン残基に置換しＫ２８をホモシステイン残基に置換して分子内Ｓ－Ｓ結合を形成させた誘導体［１７，２８－ＳＳ－Ａβ（Ｃ－ｈＣ）］も、高い凝集性と神経細胞毒性を示すことが分かった（特許文献４参照）。以下、１７位と２８位との間で分子内Ｓ－Ｓ結合を形成したＡβ４２誘導体を総称する場合、「１７，２８－ＳＳ－Ａβ４２」と表記する。
【先行技術文献】
【特許文献】
【０００８】
特開２００６－２６５１８９号公報
ＷＯ２０１６／０９２８６５国際公開公報
特開２０２１－１２３５５１（特許第７３５７３５４号）
特開２０２２－１５５７００
【非特許文献】
【０００９】
Ｉｒｉｅ，Ｋ．，Ｂｉｏｓｃｉ．Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．Ｂｉｏｃｈｅm．２０２０，８４（１），１－１６．
入江一浩、有機合成化学協会誌、２０１９，７７（１２），１２０１－１２０８．
Ｙ．Ｍａｔｓｕｓｈｉｍａ，ｅｔ．ａｌ．，ＣｈｅｍｉｃａｌＣｏｍｍｕｎｉｃａｔｉｏｎｓ，２０２０，５６（２９），４１１８－４１２１
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【００１０】
ところで、固体ＮＭＲ法による凝集体の立体構造解析から、図２に示すように、ＷＴ－Ａβ４２では２８位のリジン残基（Ｋ２８）と４２位のアラニン残基（Ａ４２）とが分子内イオン結合することによって、Ｃ末端側が２２位と２３位での毒性ターン構造とは反対側に折れ曲がった立体構造となっており、この構造で分子間βシート構造を形成している（Xiao, Y. et al., Nat. Struct. Mol. Biol. 2015, 22, 499-505. Colvin, M. T. et al., J. Am. Chem. Soc. 2016, 138, 9663-9674. Walti, M. A. et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 2016, 113, E4976-E4984. なお、Waltiの”a”は変母音）。一方、同図に示すように、ＷＴ－Ａβ４０では、ＷＴ－Ａβ４２と比較してＣ末端側が２残基分短いことから、２８位のリジン残基のアミノ基が４０位のバリン残基のカルボキシ基と分子内イオン結合することがなく、代わりに２３位のアスパラギン酸残基のカルボキシ基と分子内イオン結合を形成している。その結果、Ｃ末端側が直線的に伸びた構造となっており、この構造で分子間βシート構造を形成している（Petkova, A. T. et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 2002, 99, 16742-16747.）。このような立体構造の違いから、ＷＴ－Ａβ４２に毒性ターン構造が存在することが強く支持され、ほとんど毒性を示さないＷＴ－Ａβ４０が毒性ターン構造を取りにくい理由が明らかとなった。
（【００１１】以降は省略されています）

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