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公開番号2025123232
公報種別公開特許公報(A)
公開日2025-08-22
出願番号2025083356,2023149853
出願日2025-05-19,2019-02-05
発明の名称新規なプライマーセットを有するLAMPアッセイを用いて芝草中の真菌を検出するための方法
出願人シンジェンタパーティシペーションズアーゲー
代理人個人,個人,個人,個人
主分類C12Q 1/6895 20180101AFI20250815BHJP(生化学;ビール;酒精;ぶどう酒;酢;微生物学;酵素学;突然変異または遺伝子工学)
要約【課題】芝草サンプル中の真菌DNAを検出するための方法を提供すること。
【解決手段】ダラースポット病菌、紋枯病菌種、ピシウム・アファニデルマタム、立枯病菌種、紅色雪腐病菌種、マグナポルテ・ポアエ、コレトトリカム・グラミニコーラ、コレトトリカム・セレアレ及びキャベツピシウム腐敗病菌から選択される少なくとも1つの芝の病原性真菌の真菌DNAのプライマーを含むループ介在等温増幅(LAMP)アッセイを用いて、芝草サンプル中の真菌DNAを検出するための方法であって、芝サンプルをLAMP反応に供する工程を含み、LAMP反応は、セット中の各プライマーが15～50の核酸を有する、4つ以上の核酸配列のプライマーセットを使用する、方法を提供する。
【選択図】なし
特許請求の範囲【請求項１】
ダラースポット病菌（Ｓｃｌｅｒｏｔｉｎｉａｈｏｍｏｅｏｃａｒｐａ）、紋枯病菌（Ｒｈｉｚｏｃｔｏｎｉａｓｏｌａｎｉ）種、ピシウム・アファニデルマタム（Ｐｙｔｈｉｕｍａｐｈａｎｉｄｅｒｍａｔｕｍ）、立枯病菌（Ｇａｅｕｍａｎｎｏｍｙｃｅｓｇｒａｍｉｎｉｓ）種、紅色雪腐病菌（Ｍｉｃｒｏｄｏｃｈｉｕｍｎｉｖａｌｅ）種、マグナポルテ・ポアエ（Ｍａｇｎａｐｏｒｔｈｅｐｏａｅ）、コレトトリカム・グラミニコーラ（Ｃｏｌｌｅｔｏｔｒｉｃｈｕｍｇｒａｍｉｎｉｃｏｌａ）、コレトトリカム・セレアレ（Ｃｏｌｌｅｔｏｔｒｉｃｈｕｍｃｅｒｅａｌｅ）及びキャベツピシウム腐敗病菌（Ｐｙｔｈｉｕｍｕｌｔｉｍｕｍｖａｒ．ｕｌｔｉｍｕｍ）から選択される少なくとも１つの芝の病原性真菌の真菌ＤＮＡ用のプライマーを含むループ介在等温増幅（ＬＡＭＰ）アッセイを用いて、芝草サンプル中の真菌ＤＮＡを検出するための方法であって、
前記芝サンプルをＬＡＭＰ反応に供する工程を含み、前記ＬＡＭＰ反応は、セット中の各プライマーが１５～５０の核酸を有する、４つ以上の核酸配列のプライマーセットを使用し、前記プライマーのセットが、
（ａ）配列番号１４、１５、１６及び１７と少なくとも９０％同一である配列を各々がそれぞれ有するプライマーを含むか又はそれらから選択される、ダラースポット病菌（Ｓｃｌｅｒｏｔｉｎｉａｈｏｍｏｅｏｃａｒｐａ）ＤＮＡを検出するためのプライマーセット；
（ｂ）配列番号２０、２１、２２及び２３と少なくとも９０％同一である配列を各々がそれぞれ有するプライマーを含むか又はそれらから選択されるか、或いは配列番号６２、６３．６６及び６７と少なくとも９０％同一である配列を各々がそれぞれ有するプライマーを含むか又はそれらから選択される、紋枯病菌（Ｒｈｉｚｏｃｔｏｎｉａｓｏｌａｎｉ）ＤＮＡを検出するためのプライマーセット；
（ｃ）配列番号２６、２７、２８、及び２９と少なくとも９０％同一である配列を各々がそれぞれ有するプライマーを含むか又はそれらから選択される、紅色雪腐病菌変種ニバレ（Ｍｉｃｒｏｄｏｃｈｉｕｍｎｉｖａｌｅｖａｒ．ｎｉｖａｌｅ）ＤＮＡを検出するためのプライマーセット；
（ｄ）配列番号３２、３３、３６、及び３７と少なくとも９０％同一である配列を各々がそれぞれ有するプライマーを含むか又はそれらから選択される、ピシウム・アファニデルマタム（Ｐｙｔｈｉｕｍａｐｈａｎｉｄｅｒｍａｔｕｍ）ＤＮＡを検出するためのプライマーセット；
（ｅ）配列番号３８、３９、４２及び４３と少なくとも９０％同一である配列を各々がそれぞれ有するプライマーを含むか又はそれらから選択される、ベントグラス立枯病菌（Ｇａｅｕｍａｎｎｏｍｙｃｅｓｇｒａｍｉｎｉｓｖａｒ．ａｖｅｎａｅ）ＤＮＡを検出するためのプライマーセット、
（ｆ）配列番号４４、４５、４８及び４９と少なくとも９０％同一である配列を各々がそれぞれ有するプライマーを含むか又はそれらから選択される、紅色雪腐病菌変種マジュス（Ｍｉｃｒｏｄｏｃｈｉｕｍｎｉｖａｌｅｖａｒ．ｍａｊｕｓ）ＤＮＡを検出するためのプライマーセット；
（ｇ）配列番号５０、５１、５４及び５５と少なくとも９０％同一である配列を各々がそれぞれ有するプライマーを含むか又はそれらから選択される、マグナポルテ・ポアエ（Ｍａｇｎａｐｏｒｔｈｅｐｏａｅ）ＤＮＡを検出するためのプライマーセット；
（ｈ）配列番号７４７５、７８及び７９と少なくとも９０％同一である配列を各々がそれぞれ有するプライマーを含むか又はそれらから選択される、コレトトリカム・グラミニコーラ（Ｃｏｌｌｅｔｏｔｒｉｃｈｕｍｇｒａｍｉｎｉｃｏｌａ）ＤＮＡを検出するためのプライマーセット；
（ｉ）配列番号８０、８１、８４及び８５と少なくとも９０％同一である配列を各々がそれぞれ有するプライマーを含むか又はそれらから選択される、コレトトリカム・セレアレ（Ｃｏｌｌｅｔｏｔｒｉｃｈｕｍｃｅｒｅａｌｅ）ＤＮＡを検出するためのプライマーセット；及び
（ｊ）配列番号８６、８７、９０及び９１と少なくとも９０％同一である配列を各々がそれぞれ有するプライマーを含むか又はそれらから選択される、キャベツピシウム腐敗病菌（Ｐｙｔｈｉｕｍｕｌｔｉｍｕｍｖａｒ．Ｕｌｔｉｍｕｍ）ＤＮＡを検出するためのプライマーセット
から選択される少なくとも１つのプライマーセットを含む、方法。
続きを表示（約 1,400 文字）【請求項２】
ダラースポット病菌（Ｓｃｌｅｒｏｔｉｎｉａｈｏｍｏｅｏｃａｒｐａ）ＤＮＡを検出するための前記プライマーセットが、配列番号１４、１５、１６、１７、１８及び１９と少なくとも９０％同一である配列を各々がそれぞれ有するプライマーを含むか又はそれらから選択される、請求項１に記載の方法。
【請求項３】
紋枯病菌（Ｒｈｉｚｏｃｔｏｎｉａｓｏｌａｎｉ）ＤＮＡを検出するための前記プライマーセットが、配列番号６２、６３、６４、６５、６６及び６７と少なくとも９０％同一である配列を各々がそれぞれ有するプライマーを含むか又はそれらから選択される、請求項１に記載の方法。
【請求項４】
紋枯病菌（Ｒｈｉｚｏｃｔｏｎｉａｓｏｌａｎｉ）ＤＮＡを検出するための前記プライマーセットが、配列番号２０、２１、２２、２３、２４及び２５と少なくとも９０％同一である配列を各々がそれぞれ有するプライマーを含むか又はそれらから選択される、請求項１に記載の方法。
【請求項５】
紅色雪腐病菌変種ニバレ（Ｍｉｃｒｏｄｏｃｈｉｕｍｎｉｖａｌｅｖａｒ．ｎｉｖａｌｅ）ＤＮＡを検出するための前記プライマーセットが、配列番号２６、２７、２８、２９、３０及び３１と少なくとも９０％同一である配列を各々がそれぞれ有するプライマーを含むか又はそれらから選択される、請求項１に記載の方法。
【請求項６】
ピシウム・アファニデルマタム（Ｐｙｔｈｉｕｍａｐｈａｎｉｄｅｒｍａｔｕｍ）ＤＮＡを検出するための前記プライマーセットが、配列番号３２、３３、３４、３５、３６及び３７と少なくとも９０％同一である配列を各々がそれぞれ有するプライマーを含むか又はそれらから選択される、請求項１に記載の方法。
【請求項７】
ピシウム・アファニデルマタム（Ｐｙｔｈｉｕｍａｐｈａｎｉｄｅｒｍａｔｕｍ）ＤＮＡを検出するための前記プライマーセットが、配列番号６８、６９、７０、７１、７２及び７３と少なくとも９０％同一である配列を各々がそれぞれ有するプライマーを含むか又はそれらから選択される、請求項１に記載の方法。
【請求項８】
ベントグラス立枯病菌（Ｇａｅｕｍａｎｎｏｍｙｃｅｓｇｒａｍｉｎｉｓｖａｒ．ａｖｅｎａｅ）ＤＮＡを検出するための前記プライマーセットが、配列番号３８、３９、４０、４１、４２及び４３と少なくとも９０％同一である配列を各々がそれぞれ有するプライマーを含むか又はそれらから選択される、請求項１に記載の方法。
【請求項９】
ベントグラス立枯病菌（Ｇａｅｕｍａｎｎｏｍｙｃｅｓｇｒａｍｉｎｉｓｖａｒ．ａｖｅｎａｅ）ＤＮＡを検出するための前記プライマーセットが、配列番号５６、５７、５８、５９、６０及び６１と少なくとも９０％同一である配列を各々がそれぞれ有するプライマーを含むか又はそれらから選択される、請求項１に記載の方法。
【請求項１０】
紅色雪腐病菌変種マジュス（Ｍｉｃｒｏｄｏｃｈｉｕｍｎｉｖａｌｅｖａｒ．ｍａｊｕｓ）ＤＮＡを検出するための前記プライマーセットが、配列番号４４、４５、４６、４７、４８及び４９と少なくとも９０％同一である配列を各々がそれぞれ有するプライマーを含むか又はそれらから選択される、請求項１に記載の方法。
（【請求項１１】以降は省略されています）
発明の詳細な説明【技術分野】
【０００１】
本発明は、１つ以上の真菌に由来する核酸を検出するために、芝草のサンプルのループ介在等温増幅（ＬＡＭＰ）アッセイを用いて、真菌病原体によって引き起こされるこのような芝草における病害を検出する方法に関する。
続きを表示（約 2,900 文字）【背景技術】
【０００２】
例えば、米国特許第６４１０２７８号明細書（Ｅｉｋｅｎ）に記載されているＬＡＭＰ又はループ介在等温増幅は、標的遺伝子上の６つの異なる領域を認識するように特異的に設計された少なくとも４つ以上の異なるプライマー（例えば、ｈｔｔｐ：／／ｌｏｏｐａｍｐ．ｅｉｋｅｎ．ｃｏ．ｊｐ／ｅ／ｌａｍｐ／ｐｒｉｍｅｒ．ｈｔｍｌを参照）の使用によって特徴付けられるＤＮＡ増幅方法であり、反応プロセスは、鎖置換反応を用いて一定温度で進行する。対象とする標的核酸の増幅及び検出は、生物サンプル又はその核酸抽出物、プライマー、鎖置換活性を有するＤＮＡポリメラーゼ及び基質の混合物を一定温度（約６５’Ｃ）でインキュベートすることによって、単一工程で完了され得る。それは、高い増幅効率を提供し、ＤＮＡが、１５～６０分間で多数回増幅される。この高い特異性のため、増幅産物の存在は、標的遺伝子の存在を示し得る（ｈｔｔｐ：／／ｌｏｏｐａｍｐ．ｅｉｋｅｎ．ｃｏ．ｊｐ／ｅ／ｌａｍｐ／ｐｒｉｎｃｉｐｌｅ．ｈｔｍｌ）。
【０００３】
芝草管理者が使用者によって予測される品質基準に芝草を維持する際に直面する多くの課題がある。課題は多いが、病害（真菌病原体によって引き起こされる病害を含む）に関するものが、管理及び制御するのが特に難しい。例えば、病害は、ゴルフ場の芝草植物を侵して、プレーのしやすさ（ｐｌａｙａｂｉｌｉｔｙ）を含む品質の低下による収益の低下を引き起こし得る。ゴルフ場管理者に共通の課題の一例は、適切且つ適時な管理法を取ることができるようにどの病害が存在するかを知ることである。芝の病原微生物によって引き起こされる関連する芝の病害としては、例えば、炭疽病、テイクオールパッチ、サマーパッチ病、雪腐病、赤焼病、葉腐病及びダラースポット病が挙げられる。
【０００４】
殺真菌剤などの病原体を防除するための農業的に有効な薬品は、典型的に、病害圧力の程度、病原体集団、天候などに応じて、必要に応じてゴルフ場において施用される。しかしながら、殺真菌剤の施用は、ゴルフ場の予算（ｃｏｕｒｓｅｂｕｄｇｅｔ）、適切な設備の利用可能性、及び農業的に有効な薬品を施用するための資格のある人員の利用可能性によって高度に制御される。
【０００５】
これらの課題を考慮して、芝の病原性真菌の検出のための迅速で且つ信頼性の高いアッセイは、極めて有用であろう。公知のＰＣＲアッセイは、ゴルフ場又は他の集中的に管理された芝草又は専門的な景観環境において使用するのに実用的でないが、これは、ＰＣＲが、特殊な実験技能及び機器を必要とするためである。芝草における真菌病害を検出するための他の分子生物学方法が公知であり、例えば、ＴＲＦＬＰ方法に関する国際公開第２００９１４７０１７号に記載されている。
【先行技術文献】
【特許文献】
【０００６】
米国特許第６４１０２７８号明細書
国際公開第２００９１４７０１７号
【発明の概要】
【課題を解決するための手段】
【０００７】
したがって、本発明は、例えば、炭疽病、テイクオールパッチ、サマーパッチ病、雪腐病、赤焼病、葉腐病及びダラースポット病を含む、関連する芝の病害を引き起こす選択された真菌病原体に関連する、芝サンプル中のＤＮＡの存在を検出するためのＬＡＭＰアッセイに関する。
【０００８】
芝草病害病原体の適時な且つ効率的な検出を促進するため、並びに芝草病害処置のコスト及び有効性を改善するために、本発明に係るＬＡＭＰアッセイが、関連する芝の病害を引き起こす真菌病原体に関連するＤＮＡを早期に検出するのに用いられ得る。本発明によれば、ＬＡＭＰ方法は、標的病害病原体に由来する少なくとも４つ、好ましくは６つ以上の核酸配列のプライマーセットを好適に使用する。より特定的には、本発明に係る方法は、ＬＡＭＰアッセイのための選択されたプライマーセットにおいて使用される各プライマーが１５～５０の核酸を有し、セット中のプライマーが、標的真菌中の特異的なＤＮＡ遺伝子座から選択されると規定する。
【０００９】
本発明によれば、ダラースポット病菌（Ｓｃｌｅｒｏｔｉｎｉａｈｏｍｏｅｏｃａｒｐａ）、紋枯病菌（Ｒｈｉｚｏｃｔｏｎｉａｓｏｌａｎｉ）種、ピシウム・アファニデルマタム（Ｐｙｔｈｉｕｍａｐｈａｎｉｄｅｒｍａｔｕｍ）、立枯病菌（Ｇａｅｕｍａｎｎｏｍｙｃｅｓｇｒａｍｉｎｉｓ）種、紅色雪腐病菌（Ｍｉｃｒｏｄｏｃｈｉｕｍｎｉｖａｌｅ）種、マグナポルテ・ポアエ（Ｍａｇｎａｐｏｒｔｈｅｐｏａｅ）、コレトトリカム・グラミニコーラ（Ｃｏｌｌｅｔｏｔｒｉｃｈｕｍｇｒａｍｉｎｉｃｏｌａ）、コレトトリカム・セレアレ（Ｃｏｌｌｅｔｏｔｒｉｃｈｕｍｃｅｒｅａｌｅ）及びキャベツピシウム腐敗病菌（Ｐｙｔｈｉｕｍｕｌｔｉｍｕｍｖａｒ．ｕｌｔｉｍｕｍ）（標的真菌）からなる群から選択される芝の病原性真菌の真菌ＤＮＡ（核酸）のプライマーを含むループ介在等温増幅（ＬＡＭＰ）アッセイを用いて、芝草サンプル中の真菌ＤＮＡを検出するための方法が提供される。本発明のＬＡＭＰアッセイは、セット中の各プライマーが１５～５０の核酸を有する、少なくとも４つ、好ましくは６つ以上の核酸配列のプライマーセットを使用し、検出される真菌ＤＮＡは、標的真菌病原体から得られる。本ＬＡＭＰアッセイ方法に有用なプライマーは、改善されたアッセイ結果を得るために、標的真菌の特異的な内部転写スペーサー領域又は遺伝子から選択される。
【００１０】
特定の実施形態において、紅色雪腐病菌（Ｍｉｃｒｏｄｏｃｈｉｕｍｎｉｖａｌｅ）種の標的真菌は、紅色雪腐病菌変種ニバレ（Ｍｉｃｒｏｄｏｃｈｉｕｍｎｉｖａｌｅｖａｒ．ｎｉｖａｌｅ）及び紅色雪腐病菌変種マジュス（Ｍｉｃｒｏｄｏｃｈｉｕｍｎｉｖａｌｅｖａｒ．ｍａｊｕｓ）から選択される。別の実施形態において、立枯病菌（Ｇａｅｕｍａｎｎｏｍｙｃｅｓｇｒａｍｉｎｉｓ）種の標的真菌は、ベントグラス立枯病菌（Ｇａｅｕｍａｎｎｏｍｙｃｅｓｇｒａｍｉｎｉｓｖａｒ．ａｖｅｎａｅ）、日本シバ立枯病菌（Ｇａｅｕｍａｎｎｏｍｙｃｅｓｇｒａｍｉｎｉｓｖａｒ．ｇｒａｍｉｎｉｓ）及びコムギ立枯病菌（Ｇａｅｕｍａｎｎｏｍｙｃｅｓｇｒａｍｉｎｉｓｖａｒ．ｔｒｉｔｉｃｉ）から選択される。さらなる実施形態において、紋枯病菌（Ｒｈｉｚｏｃｔｏｎｉａｓｏｌａｎｉ）種の標的真菌は、紋枯病菌（Ｒｈｉｚｏｃｔｏｎｉａｓｏｌａｎｉ）ＡＧ２－２ＩＶ及び紋枯病菌（Ｒｈｉｚｏｃｔｏｎｉａｓｏｌａｎｉ）ＡＧ２－２ＩＩＩＢから選択される。
【発明を実施するための形態】
（【００１１】以降は省略されています）

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