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公開番号2025126919
公報種別公開特許公報(A)
公開日2025-08-29
出願番号2025074246,2023092396
出願日2025-04-28,2018-07-20
発明の名称ヒトジストロフィンプレmRNAのエクソン51に結合するアンチセンスオリゴヌクレオチド
出願人ザガヴァナーズオブザユニヴァーシティーオブアルバータ
代理人個人,個人,個人,個人,個人,個人
主分類C12N 15/113 20100101AFI20250822BHJP(生化学;ビール;酒精;ぶどう酒;酢;微生物学;酵素学;突然変異または遺伝子工学)
要約【課題】患者において観察される有効性が非常に低いというエクソンスキッピング療法における現在の大きな課題を解決する。
【解決手段】本発明は、ヒトジストロフィンプレmRNAのエクソン51に結合してエクソンスキッピングを誘導する治療用アンチセンスオリゴヌクレオチド、ならびにDMDの治療のためのそのコンジュゲートおよび組成物に関する。
【選択図】図4
特許請求の範囲【請求項１】
ヒトジストロフィンプレｍＲＮＡのエクソン５１に結合することができるアンチセンスオリゴヌクレオチドであって、アンチセンスオリゴヌクレオチドの結合は、プレｍＲＮＡ配列の０～＋８９の間の領域内でその全体が起こり、アンチセンスオリゴヌクレオチドは、少なくとも２７塩基を含む、アンチセンスオリゴヌクレオチド。
続きを表示（約 1,100 文字）【請求項２】
少なくとも２８塩基、少なくとも２９塩基、または少なくとも３０塩基を含む、請求項１に記載のアンチセンスオリゴヌクレオチド。
【請求項３】
３０塩基からなる、請求項１または２に記載のアンチセンスオリゴヌクレオチド。
【請求項４】
アンチセンスオリゴヌクレオチドの結合が、ヒトジストロフィンプレｍＲＮＡのエクソン５１の０～＋８８、０～＋８７、０～＋８６、０～＋８５、０～＋８４、０～＋８３、０～＋８２、０～＋８１、０～＋８０、０～＋７９、または０～＋７８の間の領域内でその全体が起こる、請求項１から３のいずれか１項に記載のアンチセンスオリゴヌクレオチド。
【請求項５】
アンチセンスオリゴヌクレオチドの結合が、プレｍＲＮＡ配列の０～＋７８の間の領域内でその全体が起こる、請求項１から４のいずれか１項に記載のアンチセンスオリゴヌクレオチド。
【請求項６】
前記領域内にあるヒトジストロフィンプレｍＲＮＡのエクソン５１の配列に少なくとも７０％、少なくとも８０％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、少なくとも９９％相補的である、請求項１から５のいずれか１項に記載のアンチセンスオリゴヌクレオチド。
【請求項７】
前記領域内にあるヒトジストロフィンプレｍＲＮＡのエクソン５１の配列とハイブリダイズ可能である、請求項１から６のいずれか１項に記載のアンチセンスオリゴヌクレオチド。
【請求項８】
以下の配列：配列番号１（Ａｃ０）、配列番号２（Ａｃ５）、配列番号３（Ａｃ２６）、配列番号４（Ａｃ３０）、または配列番号５（Ａｃ４８）のうちの１つの少なくとも２７塩基を含む、請求項１から７のいずれか１項に記載のアンチセンスオリゴヌクレオチド。
【請求項９】
以下の配列：配列番号１（Ａｃ０）、配列番号２（Ａｃ５）、配列番号３（Ａｃ２６）、配列番号４（Ａｃ３０）、または配列番号５（Ａｃ４８）のうちの１つと少なくとも７０％、少なくとも８０％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、または少なくとも９９％の同一性および／または相同性を有する、請求項１から８のいずれか１項に記載のアンチセンスオリゴヌクレオチド。
【請求項１０】
以下の配列：配列番号１（Ａｃ０）、配列番号２（Ａｃ５）、配列番号３（Ａｃ２６）、配列番号４（Ａｃ３０）、または配列番号５（Ａｃ４８）のうちの１つを含む、請求項１から９のいずれか１項に記載のアンチセンスオリゴヌクレオチド。
（【請求項１１】以降は省略されています）
発明の詳細な説明【技術分野】
【０００１】
関連出願の相互参照
この出願は２０１７年７月２１日に提出された英国特許出願第１７１１８０９．２号の優先権を主張し、その内容は参照により本明細書に組み込まれる。
本発明は、ヒトジストロフィンプレｍＲＮＡのエクソン５１に結合してエクソンスキッピングを誘導する治療用アンチセンスオリゴヌクレオチド、ならびにそのコンジュゲートおよび組成物に関する。本発明はさらに、筋障害、特にデュシェンヌ型筋ジストロフィーの治療のための方法およびアンチセンスオリゴヌクレオチドの使用に関する。
続きを表示（約 7,200 文字）【背景技術】
【０００２】
選択的スプライシングの破壊が多くの疾患の根底にあり、アンチセンスオリゴヌクレオチドを用いたスプライシングの調節は治療的な意味を有しうる。スプライススイッチングアンチセンスオリゴヌクレオチド（ＳＳＯ）は、アンチセンス媒介エクソンスキッピングがオープンリーディングフレームを回復させ、非機能的タンパク質の代わりに部分的または完全に機能的なタンパク質の合成を可能にしうる、神経筋疾患の新進の治療法であり、現在、脊髄性筋萎縮症（ＳＭＡ）やデュシェンヌ型筋ジストロフィー（ＤＭＤ）などの状態について、いくつかのＳＳＯで臨床試験が行われている。
【０００３】
デュシェンヌ型筋ジストロフィー（ＤＭＤ）は、世界中の男児において最も一般的な致死的遺伝性障害の１つであり、その発生率は、男性の出生数３，６００～９，３３７人中、約１人である。ＤＭＤは、ジストロフィン（ＤＭＤ）遺伝子の変異によるジストロフィンタンパク質の欠如によって引き起こされる。タンパク質をコードする遺伝子は、２００万ヌクレオチド以上のＤＮＡにまたがる７９個のエクソンを含有する。エクソンのリーディングフレームを変更する、または終止コドンを導入する、または１つまたは複数のエクソンまたは１つ以上のエクソンの重複全てのフレームからの除去を特徴とする任意のエクソン変異が、機能的なジストロフィンの産生を破壊し、ＤＭＤを生じさせる可能性を持つ。より軽度の筋ジストロフィーであるベッカー型筋ジストロフィー（ＢＭＤ）は、通常１つ以上のエクソンの欠失などの変異が、ジストロフィン転写産物全体にわたって正しいリーディングフレームを生じ、ｍＲＮＡのタンパク質への翻訳が早まって終結しない場合に生じることが見出されている。変異したジストロフィンプレｍＲＮＡのプロセッシングにおける上流と下流のエクソンの結合が、遺伝子の正しいリーディングフレームを維持する場合、その結果は、ベッカー表現型をもたらす、活性をいくらか保持した短い内部欠失を有するタンパク質をコードするｍＲＮＡである。ジストロフィンタンパク質のリーディングフレームを変えない１つまたは複数のエクソンの欠失は、ＢＭＤ表現型を引き起こす一方、フレームシフトを引き起こすエクソンの欠失は、ＤＭＤを引き起こすであろう（Monaco, Bertelson et al. 1988）。一般に、リーディングフレームを変更し、適切なタンパク質の翻訳を妨げる点変異やエクソン欠失を含むジストロフィン変異は、ＤＭＤをもたらす。
【０００４】
現在、最も有望な治療手段の１つは、アンチセンスオリゴヌクレオチド（ＡＯ）を用いたエクソンスキッピングである。エクソンスキッピングは、変異エクソンおよび／またはその隣接エクソンをＤＭＤプレｍＲＮＡから除去することでリーディングフレームを回復させ、短縮型であるが部分的に機能的なジストロフィンタンパク質の生産を可能にする。ＤＭＤ患者の大多数は欠失変異を抱えており、これらの２０％はエクソン５１のスキッピングに適している。
２０１６年９月、米国食品医薬品局（ＦＤＡ）は、変異ＤＭＤからエクソン５１を排除するために開発された、最初のＤＭＤアンチセンス薬であるエテプリルセン（エクソンディス５１）を条件付きで承認した。エテプリルセンは、その安全性と有効性の観点から定評のあるアンチセンス化学であるホスホロジアミデートモルホリノオリゴマー（モルホリノまたはＰＭＯ）で修飾されたＡＯである。しかしながら、エテプリルセンは、ジストロフィンタンパク質を治療的に有益なレベルにまで回復すること、および臨床転帰を改善することの両方に関して、薬物の有効性を支持する弱い証拠しかないため、依然として議論の的となっている。ＦＤＡは以前に、ＤＭＤエクソン５１スキッピングに関する別の候補薬である２’－Ｏ－メチル－ホスホロチオエートベースのＡＯ「ドリサペルセン」を拒絶している。治療薬は、最小限のリスクで最大限の利益を保証する必要があるが、ドリサペルセンによる治療では、筋機能の有意な改善が実証されず、その使用は安全性に対する懸念を導いた。
したがって、多くの動物試験において有意な治療効果が実証されているという事実にもかかわらず、エクソンスキッピング療法は現在、患者において観察される有効性が非常に低いという大きな課題に直面している。
【０００５】
エクソンスキッピングの効率は、ＡＯ標的配列に大きく依存する。しかしながら、エテプリルセンとドリサペルセンにより標的とされる配列が、エクソンスキッピング療法のための最適な選択肢ではないかもしれないという議論や考察はほとんどなかった。いくつかのグループが、効果的なＡＯ配列を計算的および経験的に決定するために、大規模なＡＯスクリーニングの取り組みを行ってきた。しかしながら、設計されたＡＯのエクソンスキッピング有効性は、定量的および統計的の両方で評価されていない。ジストロフィンタンパク質の発現を回復させることは、ジストロフィーの筋機能を改善するために必要であるが、ジストロフィンタンパク質の発現をレスキューするＡＯの能力は、以前のＡＯスクリーニング研究では十分な定量方法により報告されていない。他の研究は、初代ＤＭＤ筋細胞からのＲＴ－ＰＣＲに大きく依存していた。エテプリルセンとドリサペルセンのＡＯ配列が、この状況でしか決定されていないことは注目に値する。
したがって、エクソン５１スキッピング療法の有効性は、より最適なＡＯ配列を選択することにより、また臨床試験において進められるベストなアンチセンスオリゴヌクレオチドを検証するために、ＤＭＤにおいてレスキューされたジストロフィンタンパク質など、より信頼性が高く直接的な生物学的測定を使用して、より厳密なＡＯスクリーニングを実施することにより、改善されうる。
【０００６】
本発明の１つ以上の態様の目的は、当該技術分野における１つ以上のそのような課題に対処することである。
【発明の概要】
【０００７】
本発明の第１の態様によれば、ヒトジストロフィンプレｍＲＮＡのエクソン５１に結合することができるアンチセンスオリゴヌクレオチドが提供され、ここで、アンチセンスオリゴヌクレオチドの結合は、プレｍＲＮＡ配列の０～＋８９の間の領域内でその全体が（entirely）起こり、アンチセンスオリゴヌクレオチドは、少なくとも２７塩基を含む。
本発明の第２の態様によれば、第１の態様によるアンチセンスオリゴヌクレオチドおよび担体を含むコンジュゲートが提供され、ここで、担体はアンチセンスオリゴヌクレオチドにコンジュゲートされている。
本発明の第３の態様によれば、第２の態様のコンジュゲートを負荷された細胞が提供される。
本発明の第４の態様によれば、第１の態様によるアンチセンスオリゴヌクレオチド、および／または第２の態様によるコンジュゲート、および薬学的に許容される賦形剤を含む医薬組成物が提供される。
【０００８】
本発明の第５の態様によれば、ヒトジストロフィンプレｍＲＮＡのエクソン５１に結合することができる有効量のアンチセンスオリゴヌクレオチドを対象に投与することを含む、対象における筋障害を治療する方法が提供され、ここで、アンチセンスオリゴヌクレオチドの結合は、プレｍＲＮＡ配列の０～＋８９の間の領域内でその全体が起こり、アンチセンスオリゴヌクレオチドは、少なくとも２７塩基を含む。
本発明の第６の態様によれば、対象の筋障害の治療における使用のためのヒトジストロフィンプレｍＲＮＡのエクソン５１に結合することができるアンチセンスオリゴヌクレオチドが提供され、ここで、アンチセンスオリゴヌクレオチドの結合は、プレｍＲＮＡ配列の０～＋８９の間の領域内でその全体が起こり、アンチセンスオリゴヌクレオチドは、少なくとも２７塩基を含む。
本発明の第７の態様によれば、ヒトジストロフィンプレｍＲＮＡのエクソン５１に結合することができるアンチセンスオリゴヌクレオチドの有効量と細胞を接触させることを含む、細胞におけるヒトジストロフィンタンパク質発現を増加させる方法が提供され、ここで、アンチセンスオリゴヌクレオチドの結合は、プレｍＲＮＡ配列の０～＋８９の間の領域内でその全体が起こり、アンチセンスオリゴヌクレオチドは、少なくとも２７塩基を含む。
本発明の特定の実施形態が、以下の図および表を参照して、これから説明される：
【図面の簡単な説明】
【０００９】
エクソン５２欠失ＤＭＤ骨格筋細胞不死化クローン（ＫＭ５７１）における、１０μＭのアンチセンスオリゴヌクレオチド（ＡＯ）ならびにエテプリルセン（ａＥｔｅ）およびドリサペルセン（ａＤｒｉ）のアナログＡＯのｉｎｖｉｔｒｏスクリーニングを示す図である。分化した筋管をトランスフェクション後５日目に回収した。（Ａ）ワンステップＲＴ－ＰＣＲで測定したエクソン５１スキッピングの効率。代表的な画像が示される。Ｍ、１００ｂｐマーカー；ブランク、ＲＮＡテンプレートなし。（Ｂ）抗ジストロフィンＣ末端抗体を用いた定量的ウエスタンブロッティングで測定した短縮型ジストロフィンタンパク質の誘導効率。健常な８２２０細胞の検量線を使用して、レスキューされたジストロフィンタンパク質のレベルを計算する。データは３～４回の独立した実験の平均±ＳＤを表す。
**
ａＥｔｅに対しｐ＜０．０１、†ａＤｒｉに対しｐ＜０．０５および††ｐ＜０．０１、§§（Ａ）の全てのＡＯおよび（Ｂ）のＡｃ０に対しｐ＜０．０１。
５μＭのＡｃ０、Ａｃ４８、ならびにエテプリルセンおよびドリサペルセンのアナログＡＯをトランスフェクトしたエクソン５２欠失ＤＭＤ－ＫＭ５７１細胞株におけるジストロフィンのエクソン５１スキッピングおよびタンパク質の経時変化分析を示す図である。サンプルをトランスフェクション後２日目および１１日目に回収した。（Ａ）エクソン５１スキッピングのＲＴ－ＰＣＲ分析。Ｍ、１００ｂｐマーカー；Ｒ、複製番号；ブランク、ＲＮＡテンプレートなし。（Ｂ）抗ジストロフィンＣ末端抗体を用いたウエスタンブロッティングによる誘導ジストロフィンタンパク質の定量。３回の独立した実験の代表的な複製が示される。
ワンステップＲＴ－ＰＣＲおよび定量的ウエスタンブロッティングで測定した、不死化ＤＭＤ骨格筋細胞におけるＡｃ０、Ａｃ４８、ならびにエテプリルセンおよびドリサペルセンのアナログＡＯの用量依存効果を示す図である。ＤＭＤ骨格筋細胞に１、３、および１０μＭのＡＯをトランスフェクトし、トランスフェクション後５日目に回収した。（Ａ）および（Ｂ）は、エクソン５２欠失変異を有するＤＭＤ筋細胞（ＩＤＫＭ５７１）におけるエクソン５１のスキッピング効率と、レスキューされたジストロフィンタンパク質の発現レベルをそれぞれ示す。エクソン４８～５０の欠失変異を有するＤＭＤ筋細胞（ＩＤ６５９４）においてエクソン５１をスキップし、ジストロフィンタンパク質の発現をレスキューする効率が（Ｃ）および（Ｄ）にそれぞれ示される。データは、ＫＭ５７１細胞株での３～７回の独立した実験、および６５９４細胞株での３～４回の独立した実験の平均±ＳＤを表す。
*
ａＥｔｅに対しｐ＜０．０５、
**
ｐ＜０．０１；†Ａｃ４８に対しｐ＜０．０５および††ｐ＜０．０１；§同じ濃度のａＤｒｉに対しｐ＜０．０５、§§ｐ＜０．０１、ＮＳ、次の投与でのＡｃ０に対し有意性なし；ｎｓ、１０μＭでのＡｃ０に対し有意性なし。（Ｅ）回帰モデルによって分析されたＡＯに対する用量反応性。スキッピングとジストロフィンタンパク質の産生における回帰式の統計的妥当性は、それぞれｐ＜０．００８およびｐ＜０．０１４であった。プロットは、回帰分析で予測されたエクソンスキッピングまたはジストロフィンタンパク質レベルの値を示す。回帰スロープと９５％信頼区間（ＣＩ）が個々のＡＯにおいて示される。
エクソン５２（ＩＤＫＭ５７１）およびエクソン４８～５０の欠失変異（ＩＤ６５９４）を含む不死化ＤＭＤ患者由来骨格筋細胞の免疫細胞化学を示す図である。１０μＭのＡｃ０、Ａｃ４８、およびアナログエテプリルセン（ａＥｔｅ）によるトランスフェクション後５日目の細胞を抗ジストロフィンＣ末端抗体で染色した。灰色の線は、ジストロフィン陽性の筋管を示す。白い点は、ＤＡＰＩで対比染色された核を示す。＊は、収縮または培養プレートからの剥離による代表的な偽陽性筋管を示す。示される代表的な画像は、３回の独立した実験からのものである。スケールバー：１００μｍ。
Ａｃ０モルホリノアンチセンスオリゴヌクレオチドの長さの最適化を示す図である。不死化ＤＭＤ筋細胞に２５－、２６－、２７－、２８－、２９－、および３０－ｍｅｒの長さからなるＡｃ０モルホリノをトランスフェクトした。エクソン５２が欠失したＤＭＤ筋細胞（ＫＭ５７１）において１μＭ（ＡおよびＢ）および３μＭ（ＣおよびＤ）のＡｃ０モルホリノによって誘導されたエクソン５１のスキッピングの代表的な画像と定量がＲＴ－ＰＣＲにより表されるように示される。（Ｅ～Ｈ）は、エクソン４８～５０が欠失した不死化ＤＭＤ細胞の結果を示す。データは３回の独立した実験をもとに示される。
初代ＤＭＤ骨格筋細胞と健常な骨格筋細胞においてＡｃ０、Ａｃ４８、エテプリルセン（ａＥｔｅ）およびドリサペルセン（ａＤｒｉ）のアナログＡＯによって誘導されたエクソン５１のスキッピング効率を示す図である。分化した筋管に１０μＭのＡｃ０、Ａｃ４８、ならびにアナログエテプリルセンおよびドリサペルセンをトランスフェクトし、３日後に回収した。ワンステップＲＴ－ＰＣＲにより表されるエクソン５１のスキッピング効率が、エクソン４５～５０（ＩＤ４５４６）（ＡおよびＢ）またはエクソン４９～５０（ＩＤ４５５５）（ＣおよびＤ）の欠失変異を有する初代ＤＭＤ細胞、および健常な初代筋細胞（ＥおよびＦ）において示された。データは、各条件における少なくとも３連のウェルからの平均値±ＳＤを表す。Ｍ、１００ｂｐマーカー。
*
Ａｃ４８に対しｐ＜０．０５および
**
ｐ＜０．０１、††ａＥｔｅに対しｐ＜０．０１、§§ａＤｒｉに対し＜０．０１。
ｈＤＭＤ／Ｄｍｄ－ｎｕｌｌマウスモデルにおける３０－ｍｅｒのＡｃ０アンチセンスモルホリノオリゴヌクレオチドのｉｎｖｉｖｏでの有効性を示す図である。エクソンスキッピングの効率をＡｃ０モルホリノまたはアナログエテプリルセン、ａＥｔｅ（生理食塩水３０μＬ中５０μｇ）の筋肉内注射の２週間後に、前脛骨筋を用いたＲＴ－ＰＣＲによって分析した。（Ａ）マイクロチップベースのキャピラリー電気泳動システムで表されるエクソン５１スキッピングのデンシトメトリー分析。（Ｂ）エクソン５１スキッピング効率の平均割合（平均±ＳＥ）。各グループにおいてＮ＝７。Ｍ、マーカー；ＮＴ、未処置の筋肉、ＵＭ、上部マーカー色素；ＬＭ、下部マーカー色素。
ｈＤＭＤ／Ｄｍｄ－ｎｕｌｌマウスモデルにおける３０－ｍｅｒのＡｃ４８アンチセンスモルホリノオリゴヌクレオチドのｉｎｖｉｖｏでの有効性を示す図である。エクソンスキッピングの効率をＡｃ４８モルホリノまたはアナログドリサペルセンａＤｒｉ（生理食塩水３０μＬ中５０μｇ）の筋肉内注射の２週間後に、前脛骨筋を用いたＲＴ－ＰＣＲによって分析した。マイクロチップベースのキャピラリー電気泳動システムで表されるエクソン５１スキッピングのデンシトメトリー分析。Ｍ、マーカー；ＮＴ、未処置の筋肉、ＵＭ、上部マーカー色素；ＬＭ、下部マーカー色素。
【発明を実施するための形態】
【００１０】
本発明者らは、ジストロフィンプレｍＲＮＡ配列のエクソン５１の０～＋８９の初期領域内に結合し、少なくとも２７塩基の通常の長さよりも長い、それぞれが顕著な効率と有効性を有する一連のアンチセンスオリゴヌクレオチドを開発した。
アンチセンスオリゴヌクレオチドを生成するために、本発明者らはｉｎｓｉｌｉｃｏ、ｉｎｖｉｔｒｏ、およびｉｎｖｉｖｏ試験を含む体系的なスクリーニング方法を使用して、エクソン５１スキッピングに対するモルホリノベースのアンチセンスオリゴヌクレオチドの有効性を定量的に評価する研究を行った。
本発明者らは、設計されたアンチセンスオリゴヌクレオチド配列のエクソンスキッピング効率を予測するための計算分析と、その後の不死化ＤＭＤ患者由来筋細胞株におけるモルホリノアンチセンスオリゴヌクレオチドのｉｎｖｉｔｒｏ試験を使用した、組み合わせスクリーニングを実施した。この研究は、ヒトジストロフィンエクソン５１配列の冒頭、特に配列の０～＋８９の領域が、エクソンスキッピングを誘導するための非常に有望な標的領域であることを明らかにした。これは、公知のエテプリルセンおよびドリサペルセンアンチセンス療法により標的とされる内部領域とは著しく異なる。
（【００１１】以降は省略されています）

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