特許ウォッチ

公開番号2024157855
公報種別公開特許公報(A)
公開日2024-11-08
出願番号2023072476
出願日2023-04-26
発明の名称変異型テトラプレニル-β-クルクメン環化酵素及びそれを用いたアンブレインの製造方法
出願人国立大学法人新潟大学,国立研究開発法人産業技術総合研究所
代理人個人,個人
主分類C12N 15/61 20060101AFI20241031BHJP(生化学;ビール;酒精;ぶどう酒;酢;微生物学;酵素学;突然変異または遺伝子工学)
要約【課題】変異型テトラプレニル-β-クルクメン環化酵素、及びそれを用いた簡便に且つ効率的にアンブレインを得ることができるアンブレインの製造方法を提供する。
【解決手段】(a)QXXXGX(F/W)モチーフの第7番目のアミノ酸残基であるトリプトファン、(b)TALXSYAモチーフのC末から9番目のアミノ酸残基であるアスパラギン酸、及び(c)NGLYXWPモチーフの第5番目のアミノ酸残基であるプロリン、からなる群から選択される1つ以上のアミノ酸を有する変異型テトラプレニル-β-クルクメン環化酵素であって、スクアレンを基質として8α-ヒドロキシポリポダ-13,17,21-トリエン生成活性を示す、変異型テトラプレニル-β-クルクメン環化酵素を提供する。
【選択図】なし
特許請求の範囲【請求項１】
（ａ）ＱＸＸＸＧＸ（Ｆ／Ｗ）モチーフの第７番目のアミノ酸残基であるトリプトファン、（ｂ）ＴＡＬＸＳＹＡモチーフのＣ末から９番目のアミノ酸残基であるアスパラギン酸、及び（ｃ）ＮＧＬＹＸＷＰモチーフの第５番目のアミノ酸残基であるプロリン、からなる群から選択される１つ以上のアミノ酸を有する変異型テトラプレニル－β－クルクメン環化酵素であって、
（ｉ）前記変異型テトラプレニル－β－クルクメン環化酵素は、ＤＸＤＤモチーフを基準として、Ｎ末端側に１００アミノ酸残基以上離れた位置にＱＸＸＸＧＸ（Ｗ／Ｆ）モチーフ、Ｎ末端側に１８０～２５０アミノ酸残基離れた位置にＮＧＬＹＸＷＰモチーフ、Ｎ末端側に１８０～２５０アミノ酸残基離れた位置に（Ａ／Ｓ／Ｇ）ＲＸ（Ｈ／Ｎ）ＸＸＰモチーフ、Ｎ末端側に８０～１４０アミノ酸残基離れた位置に（Ｄ／Ｎ）Ｇ（Ｔ／Ｌ）（Ｌ／Ｆ／Ｙ）（Ｙ／Ｆ）ＳＹモチーフ、Ｎ末端側に２５～９０アミノ酸残基離れた位置にＴＡＬＸＳＹＡモチーフ、Ｎ末端側に１０～５０アミノ酸残基離れた位置にＱＸＸＸＸ（Ｇ／Ａ／Ｓ）Ｘ（Ｆ／Ｗ／Ｙ）モチーフ、Ｃ末端側に２０～５０アミノ酸残基離れた位置にＱＸＸＸＧＸ（Ｆ／Ｗ／Ｙ）モチーフ、Ｃ末端側に５０～１２０アミノ酸残基離れた位置にＱＸＸＸＧＸＷモチーフ、Ｃ末端側に１２０～１７０アミノ酸残基離れた位置にＱＸＸＸＧＸ（Ｆ／Ｗ）モチーフ、及びＣ末端側に１８０～２５０アミノ酸残基離れた位置に前記ＧＸＧＸ（Ｇ／Ａ／Ｐ）モチーフを有し、
（ii）配列番号１で表されるアミノ酸配列との同一性が８０％以上であり、並びに
（iii）スクアレンを基質として８α－ヒドロキシポリポダ－１３，１７，２１－トリエン生成活性を示す、
変異型テトラプレニル－β－クルクメン環化酵素。
続きを表示（約 6,000 文字）【請求項２】
前記変異型テトラプレニル－β－クルクメン環化酵素を構成するポリペプチドが、
（１）配列番号１で表されるアミノ酸配列において、配列番号１で表されるアミノ酸配列におけるＮ末端側から３２５番目のフェニルアラニンの前記（ａ）のトリプトファンへの置換、配列番号１で表されるアミノ酸配列におけるＮ末端側から３２５番目のグルタミンの前記（ｂ）のアスパラギン酸への置換、配列番号１で表されるアミノ酸配列におけるＮ末端側から１３９番目のグルタミン酸の前記（ｃ）のプロリンへの置換、又はそれらの２つ以上の組み合わせの置換を含む、アミノ酸配列からなるポリペプチド、
（２）配列番号１で表されるアミノ酸配列において、配列番号１で表されるアミノ酸配列におけるＮ末端側から３２５番目のフェニルアラニンの前記（ａ）のトリプトファンへの置換、配列番号１で表されるアミノ酸配列におけるＮ末端側から３２５番目のグルタミンの前記（ｂ）のアスパラギン酸への置換、配列番号１で表されるアミノ酸配列におけるＮ末端側から１３９番目のグルタミン酸の前記（ｃ）のプロリンへの置換、又はそれらの２つ以上の組み合わせの置換を含む、アミノ酸配列の前記置換された（ａ）、（ｂ）、及び／又は（ｃ）以外のアミノ酸配列において、１又は数個のアミノ酸が欠失、置換、挿入、及び／又は付加されたアミノ酸配列からなり、しかも、スクアレンを基質として８α－ヒドロキシポリポダ－１３，１７，２１－トリエン生成活性を示すポリペプチド、
（３）配列番号１で表されるアミノ酸配列において、配列番号１で表されるアミノ酸配列におけるＮ末端側から３２５番目のフェニルアラニンの前記（ａ）のトリプトファンへの置換、配列番号１で表されるアミノ酸配列におけるＮ末端側から３２５番目のグルタミンの前記（ｂ）のアスパラギン酸への置換、配列番号１で表されるアミノ酸配列におけるＮ末端側から１３９番目のグルタミン酸の前記（ｃ）のプロリンへの置換、又はそれらの２つ以上の組み合わせの置換を含む、アミノ酸配列の前記置換された（ａ）、（ｂ）、及び／又は（ｃ）以外のアミノ酸配列との同一性が８０％以上であるアミノ酸配列からなり、しかも、スクアレンを基質として８α－ヒドロキシポリポダ－１３，１７，２１－トリエン生成活性を示すポリペプチド、
（４）配列番号１で表されるアミノ酸配列において、配列番号１で表されるアミノ酸配列におけるＮ末端側から３２５番目のフェニルアラニンの前記（ａ）のトリプトファンへの置換、配列番号１で表されるアミノ酸配列におけるＮ末端側から３２５番目のグルタミンの前記（ｂ）のアスパラギン酸への置換、配列番号１で表されるアミノ酸配列におけるＮ末端側から１３９番目のグルタミン酸の前記（ｃ）のプロリンへの置換、又はそれらの２つ以上の組み合わせの置換を含む、アミノ酸配列を含み、しかも、スクアレンを基質として８α－ヒドロキシポリポダ－１３，１７，２１－トリエン生成活性を示すポリペプチド、
（５）配列番号１で表されるアミノ酸配列において、配列番号１で表されるアミノ酸配列におけるＮ末端側から３２５番目のフェニルアラニンの前記（ａ）のトリプトファンへの置換、配列番号１で表されるアミノ酸配列におけるＮ末端側から３２５番目のグルタミンの前記（ｂ）のアスパラギン酸への置換、配列番号１で表されるアミノ酸配列におけるＮ末端側から１３９番目のグルタミン酸の前記（ｃ）のプロリンへの置換、又はそれらの２つ以上の組み合わせの置換を含む、アミノ酸配列の前記置換された（ａ）、（ｂ）、及び／又は（ｃ）以外のアミノ酸配列において、１又は数個のアミノ酸が欠失、置換、挿入、及び／又は付加されたアミノ酸配列を含み、しかも、スクアレンを基質として８α－ヒドロキシポリポダ－１３，１７，２１－トリエン生成活性を示すポリペプチド、又は
（６）配列番号１で表されるアミノ酸配列において、配列番号１で表されるアミノ酸配列におけるＮ末端側から３２５番目のフェニルアラニンの前記（ａ）のトリプトファンへの置換、配列番号１で表されるアミノ酸配列におけるＮ末端側から３２５番目のグルタミンの前記（ｂ）のアスパラギン酸への置換、配列番号１で表されるアミノ酸配列におけるＮ末端側から１３９番目のグルタミン酸の前記（ｃ）のプロリンへの置換、又はそれらの２つ以上の組み合わせの置換を含む、アミノ酸配列の前記置換された（ａ）、（ｂ）、及び／又は（ｃ）以外のアミノ酸配列との同一性が８０％以上であるアミノ酸配列を含み、しかも、スクアレンを基質として８α－ヒドロキシポリポダ－１３，１７，２１－トリエン生成活性を示すポリペプチド、
である、請求項１に記載の変異型テトラプレニル－β－クルクメン環化酵素。
【請求項３】
前記（ａ）のトリプトファンがトリプトファン以外のアミノ酸がトリプトファンに置換されたものであり、前記（ｂ）のアスパラギン酸がアスパラギン酸以外のアミノ酸がアスパラギン酸に置換されたものであり、前記（ｃ）のプロリンがプロリン以外のアミノ酸がプロリンに置換されたものである、請求項１に記載の変異型テトラプレニル－β－クルクメン環化酵素。
【請求項４】
前記変異型テトラプレニル－β－クルクメン環化酵素が、
（１）（ｄ）ＤＸＤＤモチーフの第４番目のアミノ酸残基がシステインであるか、
（２）（ｄ）ＤＸＤＤモチーフの第４番目のアミノ酸残基がシステイン、及び（ｅ）（Ａ／Ｓ／Ｇ）ＲＸ（Ｈ／Ｎ）ＸＸＰモチーフのＮ末に隣接するアミノ酸残基がアラニンであるか、
（３）（ｄ）ＤＸＤＤモチーフの第４番目のアミノ酸残基がシステイン、及び（ｆ）ＧＸＧＸ（Ｇ／Ａ／Ｐ）モチーフの４番目のアミノ酸残基がアラニンであるか、又は
（４）（ｄ）ＤＸＤＤモチーフの第４番目のアミノ酸残基がシステイン、（ｅ）（Ａ／Ｓ／Ｇ）ＲＸ（Ｈ／Ｎ）ＸＸＰモチーフのＮ末に隣接するアミノ酸残基がアラニン、及び（ｆ）ＧＸＧＸ（Ｇ／Ａ／Ｐ）モチーフの４番目のアミノ酸残基がアラニンであり、並びに
スクアレンを基質としてアンブレイン生成活性を示す、
請求項１に記載の変異型テトラプレニル－β－クルクメン環化酵素。
【請求項５】
前記変異型テトラプレニル－β－クルクメン環化酵素を構成するポリペプチドが、配列番号１で表されるアミノ酸配列におけるＮ末端側から３２７番目のアスパラギン酸の前記（ｄ）のシステインへの置換を含み、そして
（１）配列番号１で表されるアミノ酸配列において、配列番号１で表されるアミノ酸配列におけるＮ末端側から３２５番目のフェニルアラニンの前記（ａ）のトリプトファンへの置換、配列番号１で表されるアミノ酸配列におけるＮ末端側から３２５番目のグルタミンの前記（ｂ）のアスパラギン酸への置換、配列番号１で表されるアミノ酸配列におけるＮ末端側から１３９番目のグルタミン酸の前記（ｃ）のプロリンへの置換、又は（ａ）～（ｃ）の２つ以上の組み合わせの置換を含み、そして配列番号１で表されるアミノ酸配列におけるＮ末端側から１６７番目のチロシンの前記（ｅ）のアラニンへの置換、配列番号１で表されるアミノ酸配列におけるＮ末端側から５９６番目のロイシンの前記（ｆ）のアラニンへの置換、又は（ｅ）及び（ｆ）の組み合わせの置換を更に含む、アミノ酸配列からなるポリペプチド、
（２）配列番号１で表されるアミノ酸配列において、配列番号１で表されるアミノ酸配列におけるＮ末端側から３２５番目のフェニルアラニンの前記（ａ）のトリプトファンへの置換、配列番号１で表されるアミノ酸配列におけるＮ末端側から３２５番目のグルタミンの前記（ｂ）のアスパラギン酸への置換、配列番号１で表されるアミノ酸配列におけるＮ末端側から１３９番目のグルタミン酸の前記（ｃ）のプロリンへの置換、又は（ａ）～（ｃ）の２つ以上の組み合わせの置換を含み、そして配列番号１で表されるアミノ酸配列におけるＮ末端側から１６７番目のチロシンの前記（ｅ）のアラニンへの置換、配列番号１で表されるアミノ酸配列におけるＮ末端側から５９６番目のロイシンの前記（ｆ）のアラニンへの置換、又は（ｅ）及び（ｆ）の組み合わせの置換を更に含む、アミノ酸配列の前記置換された（ａ）、（ｂ）、（ｃ）、（ｄ）、（ｅ）及び／又は（ｆ）以外のアミノ酸配列において、１又は数個のアミノ酸が欠失、置換、挿入、及び／又は付加されたアミノ酸配列からなり、しかも、スクアレンを基質としてアンブレイン生成活性を示すポリペプチド、
（３）配列番号１で表されるアミノ酸配列において、配列番号１で表されるアミノ酸配列におけるＮ末端側から３２５番目のフェニルアラニンの前記（ａ）のトリプトファンへの置換、配列番号１で表されるアミノ酸配列におけるＮ末端側から３２５番目のグルタミンの前記（ｂ）のアスパラギン酸への置換、配列番号１で表されるアミノ酸配列におけるＮ末端側から１３９番目のグルタミン酸の前記（ｃ）のプロリンへの置換、又は（ａ）～（ｃ）の２つ以上の組み合わせの置換を含み、そして配列番号１で表されるアミノ酸配列におけるＮ末端側から１６７番目のチロシンの前記（ｅ）のアラニンへの置換、配列番号１で表されるアミノ酸配列におけるＮ末端側から５９６番目のロイシンの前記（ｆ）のアラニンへの置換、又は（ｅ）及び（ｆ）の組み合わせの置換を更に含む、アミノ酸配列の前記置換された（ａ）、（ｂ）、（ｃ）、（ｄ）、（ｅ）及び／又は（ｆ）以外のアミノ酸配列との同一性が８０％以上であるアミノ酸配列からなり、しかも、スクアレンを基質としてアンブレイン生成活性を示すポリペプチド、
（４）配列番号１で表されるアミノ酸配列において、配列番号１で表されるアミノ酸配列におけるＮ末端側から３２５番目のフェニルアラニンの前記（ａ）のトリプトファンへの置換、配列番号１で表されるアミノ酸配列におけるＮ末端側から３２５番目のグルタミンの前記（ｂ）のアスパラギン酸への置換、配列番号１で表されるアミノ酸配列におけるＮ末端側から１３９番目のグルタミン酸の前記（ｃ）のプロリンへの置換、又は（ａ）～（ｃ）の２つ以上の組み合わせの置換を含み、そして配列番号１で表されるアミノ酸配列におけるＮ末端側から１６７番目のチロシンの前記（ｅ）のアラニンへの置換、配列番号１で表されるアミノ酸配列におけるＮ末端側から５９６番目のロイシンの前記（ｆ）のアラニンへの置換、又は（ｅ）及び（ｆ）の組み合わせの置換を更に含む、アミノ酸配列を含み、しかも、スクアレンを基質としてアンブレイン生成活性を示すポリペプチド、
（５）配列番号１で表されるアミノ酸配列において、配列番号１で表されるアミノ酸配列におけるＮ末端側から３２５番目のフェニルアラニンの前記（ａ）のトリプトファンへの置換、配列番号１で表されるアミノ酸配列におけるＮ末端側から３２５番目のグルタミンの前記（ｂ）のアスパラギン酸への置換、配列番号１で表されるアミノ酸配列におけるＮ末端側から１３９番目のグルタミン酸の前記（ｃ）のプロリンへの置換、又は（ａ）～（ｃ）の２つ以上の組み合わせの置換を含み、そして配列番号１で表されるアミノ酸配列におけるＮ末端側から１６７番目のチロシンの前記（ｅ）のアラニンへの置換、配列番号１で表されるアミノ酸配列におけるＮ末端側から５９６番目のロイシンの前記（ｆ）のアラニンへの置換、又は（ｅ）及び（ｆ）の組み合わせの置換を更に含む、アミノ酸配列の前記置換された（ａ）、（ｂ）、（ｃ）、（ｄ）、（ｅ）及び／又は（ｆ）以外のアミノ酸配列において、１又は数個のアミノ酸が欠失、置換、挿入、及び／又は付加されたアミノ酸配列を含み、しかも、スクアレンを基質としてアンブレイン生成活性を示すポリペプチド、又は
（６）配列番号１で表されるアミノ酸配列において、配列番号１で表されるアミノ酸配列におけるＮ末端側から３２５番目のフェニルアラニンの前記（ａ）のトリプトファンへの置換、配列番号１で表されるアミノ酸配列におけるＮ末端側から３２５番目のグルタミンの前記（ｂ）のアスパラギン酸への置換、配列番号１で表されるアミノ酸配列におけるＮ末端側から１３９番目のグルタミン酸の前記（ｃ）のプロリンへの置換、又は（ａ）～（ｃ）の２つ以上の組み合わせの置換を含み、そして配列番号１で表されるアミノ酸配列におけるＮ末端側から１６７番目のチロシンの前記（ｅ）のアラニンへの置換、配列番号１で表されるアミノ酸配列におけるＮ末端側から５９６番目のロイシンの前記（ｆ）のアラニンへの置換、又は（ｅ）及び（ｆ）の組み合わせの置換を更に含む、アミノ酸配列の前記置換された（ａ）、（ｂ）、（ｃ）、（ｄ）、（ｅ）及び／又は（ｆ）以外のアミノ酸配列との同一性が８０％以上であるアミノ酸配列を含み、しかも、スクアレンを基質としてアンブレイン生成活性を示すポリペプチド、
である、請求項４に記載の変異型テトラプレニル－β－クルクメン環化酵素。
【請求項６】
前記（ａ）のトリプトファンがトリプトファン以外のアミノ酸がトリプトファンに置換されたもの、前記（ｂ）のアスパラギン酸がアスパラギン酸以外のアミノ酸がアスパラギン酸に置換されたものであり、前記（ｃ）のプロリンがプロリン以外のアミノ酸がプロリンに置換されたものであり、前記（ｄ）のシステインがシステイン以外のアミノ酸がシステインに置換されたものであり、前記（ｅ）のアラニンがアラニン以外のアミノ酸がアラニンに置換されたものであり、前記（ｆ）のアラニンがアラニン以外のアミノ酸がアラニンに置換されたものである、請求項４に記載の変異型テトラプレニル－β－クルクメン環化酵素。
【請求項７】
請求項１～６のいずれか一項に記載の変異型テトラプレニル－β－クルクメン環化酵素をコードするポリヌクレオチド。
【請求項８】
請求項７に記載のポリヌクレオチドを有する微生物。
【請求項９】
請求項７に記載のポリヌクレオチドを持つＤＮＡを含むベクター。
【請求項１０】
請求項９に記載のベクターを有する形質転換体。
（【請求項１１】以降は省略されています）
発明の詳細な説明【技術分野】
【０００１】
本発明は、変異型テトラプレニル－β－クルクメン環化酵素及びそれを用いたアンブレインの製造方法に関する。本発明によれば、効率的にアンブレインを製造することができる。
続きを表示（約 11,000 文字）【背景技術】
【０００２】
龍涎香（ａｍｂｅｒｇｒｉｓ）は、７世紀ごろから世界各地で使用されてきた高級香料であり、漢方薬としても使用されている。龍涎香は、マッコウクジラが食物（タコ、イカ等）の不消化物を消化管分泌物により結石化させ、排泄したものと考えられているが、詳細な生成メカニズムは不明である。龍涎香の主成分はアンブレインであり、龍涎香が海上を浮遊する間に日光と酸素によって酸化分解を受け、各種の香りを持つ化合物を生成すると考えられている。
【０００３】
龍涎香の主成分アンブレインは、香料又は薬剤として用いられているが、自然界から大量に入手することは不可能である。このため、種々の有機合成法が提案されている。
【先行技術文献】
【特許文献】
【０００４】
国際公開ＷＯ２０１７／１５０６９５号パンフレット
国際公開ＷＯ２０１９／０４５０５８号パンフレット
国際公開ＷＯ２０２１／１９３８０６号パンフレット
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００５】
本発明者らは、変異型テトラプレニル－β－クルクメン環化酵素（Ｄ３７３Ｃ等）を用いることによって、スクアレンから、１個の酵素を使用した２段階の反応で、アンブレインを得る方法を見出し、提案している（特許文献１～３）。
しかしながら、これらの方法は、アンブレインの生成について改善の余地があり、更に効率的なアンブレインの産生方法が期待されていた。
従って、本発明の目的は、簡便に且つ効率的にアンブレインを得ることができるアンブレインの製造方法を提供することにある。
【課題を解決するための手段】
【０００６】
本発明者は、簡便に且つ効率的にアンブレインを得ることができるアンブレインの製造方法について、鋭意研究した結果、驚くべきことに、わずかな特定の変異を有する変異型テトラプレニル－β－クルクメン環化酵素がスクアレンから効率的に高い収率で２環性トリテルペン（８α－ヒドロキシポリポダ－１３，１７，２１－トリエン）を生成することができることを見出した。本発明者らは、更にＤ３７３Ｃ等のアミノ酸を有する変異型テトラプレニル－β－クルクメン環化酵素は、スクアレンから効率的に高い収率でアンブレインを産生することができることを見出した。
本発明は、こうした知見に基づくものである。
従って、本発明は、
［１］（ａ）ＱＸＸＸＧＸ（Ｆ／Ｗ）モチーフの第７番目のアミノ酸残基であるトリプトファン、（ｂ）ＴＡＬＸＳＹＡモチーフのＣ末から９番目のアミノ酸残基であるアスパラギン酸、及び（ｃ）ＮＧＬＹＸＷＰモチーフの第５番目のアミノ酸残基であるプロリン、からなる群から選択される１つ以上のアミノ酸を有する変異型テトラプレニル－β－クルクメン環化酵素であって、（ｉ）前記変異型テトラプレニル－β－クルクメン環化酵素は、ＤＸＤＤモチーフを基準として、Ｎ末端側に１００アミノ酸残基以上離れた位置にＱＸＸＸＧＸ（Ｗ／Ｆ）モチーフ、Ｎ末端側に１８０～２５０アミノ酸残基離れた位置にＮＧＬＹＸＷＰモチーフ、Ｎ末端側に１８０～２５０アミノ酸残基離れた位置に（Ａ／Ｓ／Ｇ）ＲＸ（Ｈ／Ｎ）ＸＸＰモチーフ、Ｎ末端側に８０～１４０アミノ酸残基離れた位置に（Ｄ／Ｎ）Ｇ（Ｔ／Ｌ）（Ｌ／Ｆ／Ｙ）（Ｙ／Ｆ）ＳＹモチーフ、Ｎ末端側に２５～９０アミノ酸残基離れた位置にＴＡＬＸＳＹＡモチーフ、Ｎ末端側に１０～５０アミノ酸残基離れた位置にＱＸＸＸＸ（Ｇ／Ａ／Ｓ）Ｘ（Ｆ／Ｗ／Ｙ）モチーフ、Ｃ末端側に２０～５０アミノ酸残基離れた位置にＱＸＸＸＧＸ（Ｆ／Ｗ／Ｙ）モチーフ、Ｃ末端側に５０～１２０アミノ酸残基離れた位置にＱＸＸＸＧＸＷモチーフ、Ｃ末端側に１２０～１７０アミノ酸残基離れた位置にＱＸＸＸＧＸ（Ｆ／Ｗ）モチーフ、及びＣ末端側に１８０～２５０アミノ酸残基離れた位置に前記ＧＸＧＸ（Ｇ／Ａ／Ｐ）モチーフを有し、（ii）配列番号１で表されるアミノ酸配列との同一性が８０％以上であり、並びに（iii）スクアレンを基質として８α－ヒドロキシポリポダ－１３，１７，２１－トリエン生成活性を示す、変異型テトラプレニル－β－クルクメン環化酵素、
［２］前記変異型テトラプレニル－β－クルクメン環化酵素を構成するポリペプチドが、（１）配列番号１で表されるアミノ酸配列において、配列番号１で表されるアミノ酸配列におけるＮ末端側から３２５番目のフェニルアラニンの前記（ａ）のトリプトファンへの置換、配列番号１で表されるアミノ酸配列におけるＮ末端側から３２５番目のグルタミンの前記（ｂ）のアスパラギン酸への置換、配列番号１で表されるアミノ酸配列におけるＮ末端側から１３９番目のグルタミン酸の前記（ｃ）のプロリンへの置換、又はそれらの２つ以上の組み合わせの置換を含む、アミノ酸配列からなるポリペプチド、（２）配列番号１で表されるアミノ酸配列において、配列番号１で表されるアミノ酸配列におけるＮ末端側から３２５番目のフェニルアラニンの前記（ａ）のトリプトファンへの置換、配列番号１で表されるアミノ酸配列におけるＮ末端側から３２５番目のグルタミンの前記（ｂ）のアスパラギン酸への置換、配列番号１で表されるアミノ酸配列におけるＮ末端側から１３９番目のグルタミン酸の前記（ｃ）のプロリンへの置換、又はそれらの２つ以上の組み合わせの置換を含む、アミノ酸配列の前記置換された（ａ）、（ｂ）、及び／又は（ｃ）以外のアミノ酸配列において、１又は数個のアミノ酸が欠失、置換、挿入、及び／又は付加されたアミノ酸配列からなり、しかも、スクアレンを基質として８α－ヒドロキシポリポダ－１３，１７，２１－トリエン生成活性を示すポリペプチド、（３）配列番号１で表されるアミノ酸配列において、配列番号１で表されるアミノ酸配列におけるＮ末端側から３２５番目のフェニルアラニンの前記（ａ）のトリプトファンへの置換、配列番号１で表されるアミノ酸配列におけるＮ末端側から３２５番目のグルタミンの前記（ｂ）のアスパラギン酸への置換、配列番号１で表されるアミノ酸配列におけるＮ末端側から１３９番目のグルタミン酸の前記（ｃ）のプロリンへの置換、又はそれらの２つ以上の組み合わせの置換を含む、アミノ酸配列の前記置換された（ａ）、（ｂ）、及び／又は（ｃ）以外のアミノ酸配列との同一性が８０％以上であるアミノ酸配列からなり、しかも、スクアレンを基質として８α－ヒドロキシポリポダ－１３，１７，２１－トリエン生成活性を示すポリペプチド、（４）配列番号１で表されるアミノ酸配列において、配列番号１で表されるアミノ酸配列におけるＮ末端側から３２５番目のフェニルアラニンの前記（ａ）のトリプトファンへの置換、配列番号１で表されるアミノ酸配列におけるＮ末端側から３２５番目のグルタミンの前記（ｂ）のアスパラギン酸への置換、配列番号１で表されるアミノ酸配列におけるＮ末端側から１３９番目のグルタミン酸の前記（ｃ）のプロリンへの置換、又はそれらの２つ以上の組み合わせの置換を含む、アミノ酸配列を含み、しかも、スクアレンを基質として８α－ヒドロキシポリポダ－１３，１７，２１－トリエン生成活性を示すポリペプチド、（５）配列番号１で表されるアミノ酸配列において、配列番号１で表されるアミノ酸配列におけるＮ末端側から３２５番目のフェニルアラニンの前記（ａ）のトリプトファンへの置換、配列番号１で表されるアミノ酸配列におけるＮ末端側から３２５番目のグルタミンの前記（ｂ）のアスパラギン酸への置換、配列番号１で表されるアミノ酸配列におけるＮ末端側から１３９番目のグルタミン酸の前記（ｃ）のプロリンへの置換、又はそれらの２つ以上の組み合わせの置換を含む、アミノ酸配列の前記置換された（ａ）、（ｂ）、及び／又は（ｃ）以外のアミノ酸配列において、１又は数個のアミノ酸が欠失、置換、挿入、及び／又は付加されたアミノ酸配列を含み、しかも、スクアレンを基質として８α－ヒドロキシポリポダ－１３，１７，２１－トリエン生成活性を示すポリペプチド、又は（６）配列番号１で表されるアミノ酸配列において、配列番号１で表されるアミノ酸配列におけるＮ末端側から３２５番目のフェニルアラニンの前記（ａ）のトリプトファンへの置換、配列番号１で表されるアミノ酸配列におけるＮ末端側から３２５番目のグルタミンの前記（ｂ）のアスパラギン酸への置換、配列番号１で表されるアミノ酸配列におけるＮ末端側から１３９番目のグルタミン酸の前記（ｃ）のプロリンへの置換、又はそれらの２つ以上の組み合わせの置換を含む、アミノ酸配列の前記置換された（ａ）、（ｂ）、及び／又は（ｃ）以外のアミノ酸配列との同一性が８０％以上であるアミノ酸配列を含み、しかも、スクアレンを基質として８α－ヒドロキシポリポダ－１３，１７，２１－トリエン生成活性を示すポリペプチド、
である、［１］に記載の変異型テトラプレニル－β－クルクメン環化酵素、
［３］前記（ａ）のトリプトファンがトリプトファン以外のアミノ酸がトリプトファンに置換されたものであり、前記（ｂ）のアスパラギン酸がアスパラギン酸以外のアミノ酸がアスパラギン酸に置換されたものであり、前記（ｃ）のプロリンがプロリン以外のアミノ酸がプロリンに置換されたものである、［１］又は［２］に記載の変異型テトラプレニル－β－クルクメン環化酵素、
［４］前記変異型テトラプレニル－β－クルクメン環化酵素が、（１）（ｄ）ＤＸＤＤモチーフの第４番目のアミノ酸残基がシステインであるか（２）（ｄ）ＤＸＤＤモチーフの第４番目のアミノ酸残基がシステイン、及び（ｅ）（Ａ／Ｓ／Ｇ）ＲＸ（Ｈ／Ｎ）ＸＸＰモチーフのＮ末に隣接するアミノ酸残基がアラニンであるか、（３）（ｄ）ＤＸＤＤモチーフの第４番目のアミノ酸残基がシステイン、及び（ｆ）ＧＸＧＸ（Ｇ／Ａ／Ｐ）モチーフの４番目のアミノ酸残基がアラニンであるか、又は（４）（ｄ）ＤＸＤＤモチーフの第４番目のアミノ酸残基がシステイン、（ｅ）（Ａ／Ｓ／Ｇ）ＲＸ（Ｈ／Ｎ）ＸＸＰモチーフのＮ末に隣接するアミノ酸残基がアラニン、及び（ｆ）ＧＸＧＸ（Ｇ／Ａ／Ｐ）モチーフの４番目のアミノ酸残基がアラニンであり、並びにスクアレンを基質としてアンブレイン生成活性を示す、［１］に記載の変異型テトラプレニル－β－クルクメン環化酵素、
［５］前記変異型テトラプレニル－β－クルクメン環化酵素を構成するポリペプチドが、配列番号１で表されるアミノ酸配列におけるＮ末端側から３２７番目のアスパラギン酸の前記（ｄ）のシステインへの置換を含み、そして
（１）配列番号１で表されるアミノ酸配列において、配列番号１で表されるアミノ酸配列におけるＮ末端側から３２５番目のフェニルアラニンの前記（ａ）のトリプトファンへの置換、配列番号１で表されるアミノ酸配列におけるＮ末端側から３２５番目のグルタミンの前記（ｂ）のアスパラギン酸への置換、配列番号１で表されるアミノ酸配列におけるＮ末端側から１３９番目のグルタミン酸の前記（ｃ）のプロリンへの置換、又は（ａ）～（ｃ）の２つ以上の組み合わせの置換を含み、そして配列番号１で表されるアミノ酸配列におけるＮ末端側から１６７番目のチロシンの前記（ｅ）のアラニンへの置換、配列番号１で表されるアミノ酸配列におけるＮ末端側から５９６番目のロイシンの前記（ｆ）のアラニンへの置換、又は（ｅ）及び（ｆ）の組み合わせの置換を更に含む、アミノ酸配列からなるポリペプチド、
（２）配列番号１で表されるアミノ酸配列において、配列番号１で表されるアミノ酸配列におけるＮ末端側から３２５番目のフェニルアラニンの前記（ａ）のトリプトファンへの置換、配列番号１で表されるアミノ酸配列におけるＮ末端側から３２５番目のグルタミンの前記（ｂ）のアスパラギン酸への置換、配列番号１で表されるアミノ酸配列におけるＮ末端側から１３９番目のグルタミン酸の前記（ｃ）のプロリンへの置換、又は（ａ）～（ｃ）の２つ以上の組み合わせの置換を含み、そして配列番号１で表されるアミノ酸配列におけるＮ末端側から１６７番目のチロシンの前記（ｅ）のアラニンへの置換、配列番号１で表されるアミノ酸配列におけるＮ末端側から５９６番目のロイシンの前記（ｆ）のアラニンへの置換、又は（ｅ）及び（ｆ）の組み合わせの置換を更に含む、アミノ酸配列の前記置換された（ａ）、（ｂ）、（ｃ）、（ｄ）、（ｅ）及び／又は（ｆ）以外のアミノ酸配列において、１又は数個のアミノ酸が欠失、置換、挿入、及び／又は付加されたアミノ酸配列からなり、しかも、スクアレンを基質としてアンブレイン生成活性を示すポリペプチド、
（３）配列番号１で表されるアミノ酸配列において、配列番号１で表されるアミノ酸配列におけるＮ末端側から３２５番目のフェニルアラニンの前記（ａ）のトリプトファンへの置換、配列番号１で表されるアミノ酸配列におけるＮ末端側から３２５番目のグルタミンの前記（ｂ）のアスパラギン酸への置換、配列番号１で表されるアミノ酸配列におけるＮ末端側から１３９番目のグルタミン酸の前記（ｃ）のプロリンへの置換、又は（ａ）～（ｃ）の２つ以上の組み合わせの置換を含み、そして配列番号１で表されるアミノ酸配列におけるＮ末端側から１６７番目のチロシンの前記（ｅ）のアラニンへの置換、配列番号１で表されるアミノ酸配列におけるＮ末端側から５９６番目のロイシンの前記（ｆ）のアラニンへの置換、又は（ｅ）及び（ｆ）の組み合わせの置換を更に含む、アミノ酸配列の前記置換された（ａ）、（ｂ）、（ｃ）、（ｄ）、（ｅ）及び／又は（ｆ）以外のアミノ酸配列との同一性が８０％以上であるアミノ酸配列からなり、しかも、スクアレンを基質としてアンブレイン生成活性を示すポリペプチド、
（４）配列番号１で表されるアミノ酸配列において、配列番号１で表されるアミノ酸配列におけるＮ末端側から３２５番目のフェニルアラニンの前記（ａ）のトリプトファンへの置換、配列番号１で表されるアミノ酸配列におけるＮ末端側から３２５番目のグルタミンの前記（ｂ）のアスパラギン酸への置換、配列番号１で表されるアミノ酸配列におけるＮ末端側から１３９番目のグルタミン酸の前記（ｃ）のプロリンへの置換、又は（ａ）～（ｃ）の２つ以上の組み合わせの置換を含み、そして配列番号１で表されるアミノ酸配列におけるＮ末端側から１６７番目のチロシンの前記（ｅ）のアラニンへの置換、配列番号１で表されるアミノ酸配列におけるＮ末端側から５９６番目のロイシンの前記（ｆ）のアラニンへの置換、又は（ｅ）及び（ｆ）の組み合わせの置換を更に含む、アミノ酸配列を含み、しかも、スクアレンを基質としてアンブレイン生成活性を示すポリペプチド、
（５）配列番号１で表されるアミノ酸配列において、配列番号１で表されるアミノ酸配列におけるＮ末端側から３２５番目のフェニルアラニンの前記（ａ）のトリプトファンへの置換、配列番号１で表されるアミノ酸配列におけるＮ末端側から３２５番目のグルタミンの前記（ｂ）のアスパラギン酸への置換、配列番号１で表されるアミノ酸配列におけるＮ末端側から１３９番目のグルタミン酸の前記（ｃ）のプロリンへの置換、又は（ａ）～（ｃ）の２つ以上の組み合わせの置換を含み、そして配列番号１で表されるアミノ酸配列におけるＮ末端側から１６７番目のチロシンの前記（ｅ）のアラニンへの置換、配列番号１で表されるアミノ酸配列におけるＮ末端側から５９６番目のロイシンの前記（ｆ）のアラニンへの置換、又は（ｅ）及び（ｆ）の組み合わせの置換を更に含む、アミノ酸配列の前記置換された（ａ）、（ｂ）、（ｃ）、（ｄ）、（ｅ）及び／又は（ｆ）以外のアミノ酸配列において、１又は数個のアミノ酸が欠失、置換、挿入、及び／又は付加されたアミノ酸配列を含み、しかも、スクアレンを基質としてアンブレイン生成活性を示すポリペプチド、又は
（６）配列番号１で表されるアミノ酸配列において、配列番号１で表されるアミノ酸配列におけるＮ末端側から３２５番目のフェニルアラニンの前記（ａ）のトリプトファンへの置換、配列番号１で表されるアミノ酸配列におけるＮ末端側から３２５番目のグルタミンの前記（ｂ）のアスパラギン酸への置換、配列番号１で表されるアミノ酸配列におけるＮ末端側から１３９番目のグルタミン酸の前記（ｃ）のプロリンへの置換、又は（ａ）～（ｃ）の２つ以上の組み合わせの置換を含み、そして配列番号１で表されるアミノ酸配列におけるＮ末端側から１６７番目のチロシンの前記（ｅ）のアラニンへの置換、配列番号１で表されるアミノ酸配列におけるＮ末端側から５９６番目のロイシンの前記（ｆ）のアラニンへの置換、又は（ｅ）及び（ｆ）の組み合わせの置換を更に含む、アミノ酸配列の前記置換された（ａ）、（ｂ）、（ｃ）、（ｄ）、（ｅ）及び／又は（ｆ）以外のアミノ酸配列との同一性が８０％以上であるアミノ酸配列を含み、しかも、スクアレンを基質としてアンブレイン生成活性を示すポリペプチド、
である、［４］に記載の変異型テトラプレニル－β－クルクメン環化酵素、
［６］前記（ａ）のトリプトファンがトリプトファン以外のアミノ酸がトリプトファンに置換されたもの、前記（ｂ）のアスパラギン酸がアスパラギン酸以外のアミノ酸がアスパラギン酸に置換されたものであり、前記（ｃ）のプロリンがプロリン以外のアミノ酸がプロリンに置換されたものであり、前記（ｄ）のシステインがシステイン以外のアミノ酸がシステインに置換されたものであり、前記（ｅ）のアラニンがアラニン以外のアミノ酸がアラニンに置換されたものであり、前記（ｆ）のアラニンがアラニン以外のアミノ酸がアラニンに置換されたものである、［４］又は［５］に記載の変異型テトラプレニル－β－クルクメン環化酵素、
［７］［１］～［６］のいずれかに記載の変異型テトラプレニル－β－クルクメン環化酵素をコードするポリヌクレオチド、
［８］［７］に記載のポリヌクレオチドを有する微生物、
［９］［７］に記載のポリヌクレオチドを持つＤＮＡを含むベクター、
［１０］［９］に記載のベクターを有する形質転換体、
［１１］［１］～［３］のいずれかに記載の変異型テトラプレニル－β－クルクメン環化酵素をスクアレンに反応させて、８α－ヒドロキシポリポダ－１３，１７，２１－トリエンを得ることを特徴とする、８α－ヒドロキシポリポダ－１３，１７，２１－トリエンの製造方法、
［１２］［４］～［６］のいずれかに記載の変異型テトラプレニル－β－クルクメン環化酵素をスクアレンに反応させて、アンブレインを得ることを特徴とする、アンブレインの製造方法、
［１３］［８］に記載の微生物を培養することを特徴とする、アンブレインの製造方法、及び
［１４］［１０］に記載の形質転換体を培養することを特徴とする、アンブレインの製造方法、
に関する。
【発明の効果】
【０００７】
本発明の変異型テトラプレニル－β－クルクメン環化酵素によれば、耐熱性が向上し、従来より高い温度で効率的に２環性トリテルペン（８α－ヒドロキシポリポダ－１３，１７，２１－トリエン）及び／又はアンブレインを産生することができる。特に、大腸菌の平均的な培養温度である３７℃付近における酵素活性を向上させることができる。
【図面の簡単な説明】
【０００８】
野生型テトラプレニル－β－クルクメン環化酵素（ＷＴ）、１３９番目のグルタミン酸がプロリンに置換したＥ１３９Ｐ、３２５番目のグルタミンがアスパラギンに置換したＱ３２５Ｄ、５３０番目のフェニルアラニンがトリプトファンに置換したＦ５３０Ｗ、及びそれらの３つの置換を有するＥ１３９Ｐ／Ｑ３２５Ｄ／Ｆ５３０Ｗについてスクアレンを基質として、３６℃で２環化合物（８α－ヒドロキシポリポダ－１３，１７，２１－トリエン）を産生する活性を示したグラフである。
１６７番目のチロシンがアラニンに置換し、そして３７３番目のアスパラギン酸がシステインに置換したＹ１６７Ａ／Ｄ３７３Ｃ、Ｙ１６７Ａ／Ｄ３７３Ｃ／Ｅ１３９Ｐ、Ｙ１６７Ａ／Ｄ３７３Ｃ／Ｑ３２５Ｄ、Ｙ１６７Ａ／Ｄ３７３Ｃ／Ｆ５３０Ｗ、Ｙ１６７Ａ／Ｄ３７３Ｃ／Ｅ１３９Ｐ／Ｑ３２５Ｄ／Ｆ５３０Ｗについて、スクアレンを基質として、３６℃でアンブレインを産生する活性を示したグラフである。
野生型テトラプレニル－β－クルクメン環化酵素（ＷＴ）及びＥ１３９Ｐ／Ｑ３２５Ｄ／Ｆ５３０Ｗ（ＥＱＦ）のスクアレンを基質として、３０℃、３３℃、又は３６℃で２環化合物（８α－ヒドロキシポリポダ－１３，１７，２１－トリエン）を産生する活性を示したグラフである。
野生型テトラプレニル－β－クルクメン環化酵素（WildType）、Ｅ１３９Ｐ、Ｑ３２５Ｄ、Ｆ５３０Ｗ、及びＥ１３９Ｐ／Ｑ３２５Ｄ／Ｆ５３０Ｗ、Ｙ１６７Ａ／Ｄ３７３Ｃ、Ｙ１６７Ａ／Ｄ３７３Ｃ／Ｅ１３９Ｐ、Ｙ１６７Ａ／Ｄ３７３Ｃ／Ｑ３２５Ｄ、Ｙ１６７Ａ／Ｄ３７３Ｃ／Ｆ５３０Ｗ、Ｙ１６７Ａ／Ｄ３７３Ｃ／Ｅ１３９Ｐ／Ｑ３２５Ｄ／Ｆ５３０Ｗ、及びＹ１６７Ａ／Ｄ３７３Ｃ／Ｌ５９６Ａ／Ｅ１３９Ｐ／Ｑ３２５Ｄ／Ｆ５３０Ｗのアミノ酸配列を示した図である。
野生型テトラプレニル－β－クルクメン環化酵素（WildType）、Ｅ１３９Ｐ、Ｑ３２５Ｄ、Ｆ５３０Ｗ、及びＥ１３９Ｐ／Ｑ３２５Ｄ／Ｆ５３０Ｗ、Ｙ１６７Ａ／Ｄ３７３Ｃ、Ｙ１６７Ａ／Ｄ３７３Ｃ／Ｅ１３９Ｐ、Ｙ１６７Ａ／Ｄ３７３Ｃ／Ｑ３２５Ｄ、Ｙ１６７Ａ／Ｄ３７３Ｃ／Ｆ５３０Ｗ、Ｙ１６７Ａ／Ｄ３７３Ｃ／Ｅ１３９Ｐ／Ｑ３２５Ｄ／Ｆ５３０Ｗ、及びＹ１６７Ａ／Ｄ３７３Ｃ／Ｌ５９６Ａ／Ｅ１３９Ｐ／Ｑ３２５Ｄ／Ｆ５３０Ｗのアミノ酸配列を示した図である。
野生型テトラプレニル－β－クルクメン環化酵素（WildType）、Ｅ１３９Ｐ、Ｑ３２５Ｄ、Ｆ５３０Ｗ、及びＥ１３９Ｐ／Ｑ３２５Ｄ／Ｆ５３０Ｗ、Ｙ１６７Ａ／Ｄ３７３Ｃ、Ｙ１６７Ａ／Ｄ３７３Ｃ／Ｅ１３９Ｐ、Ｙ１６７Ａ／Ｄ３７３Ｃ／Ｑ３２５Ｄ、Ｙ１６７Ａ／Ｄ３７３Ｃ／Ｆ５３０Ｗ、Ｙ１６７Ａ／Ｄ３７３Ｃ／Ｅ１３９Ｐ／Ｑ３２５Ｄ／Ｆ５３０Ｗ、及びＹ１６７Ａ／Ｄ３７３Ｃ／Ｌ５９６Ａ／Ｅ１３９Ｐ／Ｑ３２５Ｄ／Ｆ５３０Ｗのアミノ酸配列を示した図である。
野生型バチルス・メガテリウム、プリエスティア・アリアブハッタイ（Priestia aryabhattai）、及びバチルス・メガテリウムＱ３株（Bacillus Megaterium strain Q3）のアミノ酸配列を示した図である。
【発明を実施するための形態】
【０００９】
（テトラプレニル－β－クルクメン環化酵素）
野生型のテトラプレニル－β－クルクメン環化酵素（以下、野生型ＴＣと称することがある）は、片末端に単環を有する３－デオキシアキレオールＡを基質として利用し、アンブレインを生成することができる。すなわち、テトラプレニル－β－クルクメン環化酵素は、３－デオキシアキレオールＡを基質として利用すると、３－デオキシアキレオールＡの環状化されていない端を選択的に環化させて、両末端環化化合物を生成することができる。
また、テトラプレニル－β－クルクメン環化酵素は、スクアレンを基質とし、２環性の８α－ヒドロキシポリポダ－１３，１７，２１－トリエンを生成することができる。
すなわち、テトラプレニル－β－クルクメン環化酵素は、ＥＣ４．２．１．１２９に分類され、水とテトラプレニル－β－クルクメンからバチテルペノールＡを生成する反応、又は、スクアレンから８α－ヒドロキシポリポダ－１３，１７，２１－トリエンを生成する反応を触媒し得る酵素である。
テトラプレニル－β－クルクメン環化酵素は、例えばバチルス属、ブレビバチルス属、パエニバチルス属、又はジオバチルス属などの細菌が有している。バチルス属の細菌としては、枯草菌（バチルス・サブチルス）、バチルス・メガテリウム、プリエスティア・アリアブハッタイ（Priestia aryabhattai）又はバチルス・リケニフォルミスを挙げることができる。
【００１０】
テトラプレニル－β－クルクメン環化酵素は、ＤＸＤＤモチーフを基準として、Ｎ末端側に１００アミノ酸残基以上離れた位置にＱＸＸＸＧＸ（Ｗ／Ｆ）モチーフ、Ｎ末端側に１８０～２８０アミノ酸残基離れた位置にＮＧＬＹＸＷＰモチーフ、Ｎ末端側に１８０～２５０アミノ酸残基離れた位置に前記（Ａ／Ｓ／Ｇ）ＲＸ（Ｈ／Ｎ）ＸＸＰモチーフ、Ｎ末端側に８０～１４０アミノ酸残基離れた位置に前記（Ｄ／Ｎ）Ｇ（Ｔ／Ｌ）（Ｌ／Ｆ／Ｙ）（Ｙ／Ｆ）ＳＹモチーフ、Ｎ末端側に２５～９０アミノ酸残基離れた位置にＴＡＬＸＳＹＡモチーフ、Ｎ末端側に１０～５０アミノ酸残基離れた位置にＱＸＸＸＸ（Ｇ／Ａ／Ｓ）Ｘ（Ｆ／Ｗ／Ｙ）モチーフ、Ｃ末端側に２０～５０アミノ酸残基離れた位置にＱＸＸＸＧＸ（Ｆ／Ｗ／Ｙ）モチーフ、Ｃ末端側に５０～１２０アミノ酸残基離れた位置にＱＸＸＸＧＸＷモチーフ、Ｃ末端側に１２０～１７０アミノ酸残基離れた位置にＱＸＸＸＧＸ（Ｆ／Ｗ）モチーフ、及びＣ末端側に１８０～２５０アミノ酸残基離れた位置に前記ＧＸＧＸ（Ｇ／Ａ／Ｐ）モチーフを有している。
本明細書における「ＤＸＤＤモチーフ」とは、テトラプレニル－β－クルクメン環化酵素において、閉環反応の開始を触媒するＤ３７２（例えば、配列番号１で表されるバチルス・メガテリウムのテトラプレニル－β－クルクメン環化酵素の３７２番目のアスパラギン酸）を含むＤＸＤＤの配列であり、由来の異なるテトラプレニル－β－クルクメン環化酵素において保存性が高い領域を意味する。本明細書において「ＤＸＤＤモチーフを基準とする」とは、テトラプレニル－β－クルクメン環化酵素の中央部よりＣ末側に存在するＤＸＤＤモチーフから、各モチーフの位置を特定するものであり、例えばＱＸＸＸＧＸ（Ｗ／Ｆ）モチーフは「ＤＸＤＤモチーフを基準として、Ｎ末端側に１００アミノ酸残基以上離れた位置」に存在するが、これはＤＸＤＤモチーフのＮ末に隣接するアミノ酸残基を１として、１００アミノ酸残基以上離れた位置にＱＸＸＸＧＸ（Ｗ／Ｆ）モチーフが存在することを意味する。
（【００１１】以降は省略されています）

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