特許ウォッチ

公開番号2025113367
公報種別公開特許公報(A)
公開日2025-08-01
出願番号2025084085,2021562760
出願日2025-05-20,2020-12-04
発明の名称生理活性を有するペプチドの製造方法及び短鎖リンカーを含むペプチド
出願人味の素株式会社
代理人個人,個人,個人,個人,個人,個人
主分類C07K 19/00 20060101AFI20250725BHJP(有機化学)
要約【課題】ダイマーペプチド等の複雑なペプチド分子を、従来の化学合成手法と比較して簡便かつ安価に製造する方法や、特定の短鎖リンカーを含む良好な活性を有するダイマーペプチド等を提供する。
【解決手段】(I)第1の生理活性ペプチド部位と、
(II)49個以下のアミノ酸残基からなるリンカー部位と、
(III)前記リンカー部位を介して前記第1の生理活性ペプチド部位とは反対側に位置する第2の生理活性ペプチド部位と
を含むペプチド分子であって、
前記第1の生理活性ペプチド部位と前記第2の生理活性ペプチド部位が、互いに同じであっても異なっていてもよく、
前記リンカー部位のアミノ酸配列の少なくとも90%がアラニン(A)、プロリン(P)及びセリン(S)から選択されるアミノ酸残基からなる、前記ペプチド分子。
【選択図】なし
特許請求の範囲【請求項１】
（I）第１の生理活性ペプチド部位と、
（II）４９個以下のアミノ酸残基からなるリンカー部位と、
（III）前記リンカー部位を介して前記第１の生理活性ペプチド部位とは反対側に位置する第２の生理活性ペプチド部位と
を含むペプチド分子であって、
前記第１の生理活性ペプチド部位と前記第２の生理活性ペプチド部位が、互いに同じであっても異なっていてもよく、
前記リンカー部位のアミノ酸配列の少なくとも９０％がアラニン（A）、プロリン（P）及びセリン（S）から選択されるアミノ酸残基からなる、前記ペプチド分子。
続きを表示（約 2,300 文字）【請求項２】
前記第１の生理活性ペプチド部位が環状ペプチドを構成している、及び／又は前記第２の生理活性ペプチド部位が環状ペプチドを構成している、請求項１に記載のペプチド分子。
【請求項３】
前記第１の生理活性ペプチド部位が、ジスルフィド結合により環状構造が形成された環状ペプチドを構成している、及び／又は前記第２の生理活性ペプチド部位が、ジスルフィド結合により環状構造が形成された環状ペプチドを構成している、請求項１又は２に記載のペプチド分子。
【請求項４】
前記第１の生理活性ペプチド部位と前記第２の生理活性ペプチド部位が、それぞれ、c-Metタンパク質に結合する環状ペプチドを構成しており、互いに同じであっても異なっていてもよい、請求項１～３のいずれか１項に記載のペプチド分子。
【請求項５】
前記環状ペプチドが、以下の（a）～（i）から選択されるアミノ酸配列を含む、ジスルフィド結合により環状構造を形成している環状ペプチドである、請求項４に記載のペプチド分子。
（a）CYRQFNRRTHEVWNLDC（配列番号：１）；
（b）CRQFNRRTHEVWNLDC（配列番号：２）；
（c）CYWYYAWDQTYKAFPC（配列番号：３）；
（d）CWYYAWDQTYKAFPC（配列番号：４）；
（e）CYISWNEFNSPNWRFITC（配列番号：５）；
（f）CISWNEFNSPNWRFITC（配列番号：６）；
（g）（a）～（f）のいずれかのアミノ酸配列において、システイン残基以外の１又は２個のアミノ酸残基が置換、欠失又は付加されており、かつc-Metタンパク質に結合するペプチド；
（h）（a）～（f）のいずれかのアミノ酸配列と90％以上の配列同一性を有し、但し両端のシステイン残基を有しているアミノ酸配列からなり、かつc-Metタンパク質に結合するペプチド；及び
（i）（a）～（h）のいずれかのアミノ酸配列において、両端のシステイン残基以外の少なくとも１つのアミノ酸が修飾されているペプチド（アミノ酸の修飾は、リン酸化、メチル化、アセチル化、アデニリル化、ADPリボシル化又は糖鎖付加である。）
【請求項６】
前記第１の生理活性ペプチド部位と前記第２の生理活性ペプチド部位が、それぞれ、エリスロポエチン受容体に結合する環状ペプチドを構成しており、互いに同じであっても異なっていてもよい、請求項１～３のいずれか１項に記載のペプチド分子。
【請求項７】
前記環状ペプチドが、以下の（j）～（n）から選択されるアミノ酸配列を含む、ジスルフィド結合により環状構造を形成している環状ペプチドである、請求項６に記載のペプチド分子。
（j）GGLYACHMGPMTWVCQPLRG（配列番号：６５）；
（k）CISWNEFNSPNWRFITC（配列番号：６６）；
（l）（j）又は（k）のアミノ酸配列において、システイン残基以外の１又は２個のアミノ酸残基が置換、欠失又は付加されており、かつエリスロポエチン受容体に結合するペプチド；
（m）（j）又は（k）のいずれかのアミノ酸配列と90％以上の配列同一性を有し、但しシステイン残基を（j）又は（k）におけるそのままの位置で有しているアミノ酸配列からなり、かつエリスロポエチン受容体に結合するペプチド；及び
（n）（j）～（m）のいずれかのアミノ酸配列において、システイン残基以外の少なくとも１つのアミノ酸が修飾されているペプチド（アミノ酸の修飾は、リン酸化、メチル化、アセチル化、アデニリル化、ADPリボシル化又は糖鎖付加である。）
【請求項８】
前記第１の生理活性ペプチド部位と前記第２の生理活性ペプチド部位が、それぞれ、トロンボポエチン受容体に結合する生理活性ペプチドからなり、互いに同じであっても異なっていてもよい、請求項１～３のいずれか１項に記載のペプチド分子。
【請求項９】
前記生理活性ペプチドが、以下の（o）～（u）から選択されるアミノ酸配列を含む、請求項８に記載のペプチド分子。
（o）IEGPTLRQWLAARA（配列番号：６７）；
（p）GGCADGPTLREWISFCGG（配列番号：６８）；
（q）GGCTLREWLHGGFCGG（配列番号：６９）；
（r）LAIEGPTLRQWLHGNGRDT（配列番号：７０）；
（s）（o）～（r）のいずれかのアミノ酸配列において、システイン残基以外の１又は２個のアミノ酸残基が置換、欠失又は付加されており、かつトロンボポエチン受容体に結合するペプチド；
（t）（o）～（r）のいずれかのアミノ酸配列と90％以上の配列同一性を有し、但し（p）又は（q）を基準とする場合にはシステイン残基を（p）又は（q）におけるそのままの位置で有しているアミノ酸配列からなり、かつトロンボポエチン受容体に結合するペプチド；及び
（u）（o）～（t）のいずれかのアミノ酸配列において、システイン残基以外の少なくとも１つのアミノ酸が修飾されているペプチド（アミノ酸の修飾は、リン酸化、メチル化、アセチル化、アデニリル化、ADPリボシル化又は糖鎖付加である。）
【請求項１０】
前記リンカー部位（II）と隣接しない位置で、機能性修飾部位を更に含む、請求項１～９のいずれか１項に記載のペプチド分子。
（【請求項１１】以降は省略されています）
発明の詳細な説明【技術分野】
【０００１】
本発明は、生理活性を有するペプチドの製造方法及び短鎖リンカーを含むペプチド等に関する。
続きを表示（約 17,000 文字）【背景技術】
【０００２】
近年、医薬のモダリティとして、抗体医薬等のバイオ医薬品、再生医療、核酸医薬等が研究され、実際に用いられるようになってきた。また、新しい医薬のモダリティとして、中分子、特にペプチドが着目されている。特に、環状ペプチド等の特殊な形状のペプチド（特殊ペプチド）が複数開発されており、医薬への応用が期待されるところである。
そのような状況下、ダイマーペプチドやペプチド複合体の開発が今後加速すると考えられる。例えば、ダイマーペプチドに関しては、Apellis PharmaceuticalsのAPL-2が、加齢黄斑変性症等の治療薬として臨床研究されており、実用化が期待されている。
【０００３】
ダイマーペプチドは、２つのペプチド鎖を短鎖リンカーで連結する構造を有し、また、ペプチド複合体は、ペプチド鎖と薬物を短鎖リンカーで連結する構造を有するのが一般的である。このような短鎖リンカーとしては、PEGリンカーが主に用いられている。
しかしながら、ダイマーペプチドやペプチド複合体の製造において、従来の化学合成手法では、ペプチド鎖の化学合成、PEGリンカーの付加、及び精製を行う必要があり、多くの製造工程を経る必要があった。また、ペプチドが環状ペプチドである場合には、更にペプチド鎖の環状化を行わなければならない。そのため、ダイマーペプチドやペプチド複合体を従来の化学合成手法で製造するには、複雑な工程を経る必要があり、非常に手間がかかっていた。その上、従来の化学合成手法では、第１のペプチドと第２のペプチドをPEGリンカーを介して結合させてなるダイマーペプチドの合成において、第１のペプチドのＣ末端がリンカーに結合し、第２のペプチドについてもＣ末端がリンカーに結合するものが得られ、第１のペプチドのＣ末端がリンカーに結合し、第２のペプチドのＮ末端がリンカーに結合するようなダイマーペプチドの効率的な合成は行うことができない。
加えて、主に使用されているPEGリンカーが高価であり、従来の化学合成手法では経済的にも好ましいとは言えない。
【０００４】
特表２０１３－５３１４８０には、生物学的に活性なタンパク質と、少なくとも５０個のプロリンおよびアラニンのアミノ酸残基からなるアミノ酸配列を含むランダムコイルポリペプチドとを含む、薬物コンジュゲートが記載されている。特許文献１においては、当該ランダムコイルポリペプチドが、薬物コンジュゲートの増加した血中安定性をもたらすことが記載されている。
しかしながら、特表２０１３－５３１４８０には、当該ランダムコイルポリペプチドを、ダイマーペプチドやペプチド複合体におけるPEGリンカーのような短鎖リンカーの代わりに用いることについての具体的な開示はない。
また、ダイマーペプチド等のペプチド分子を医薬として利用するには、ダイマーペプチド等のペプチド分子の安定性の向上だけでなく、活性の維持又は向上も望まれる。２つのペプチド鎖を連結する短鎖リンカーとしてPEGリンカーが主に用いられていること、及びPEGリンカーの使用には製造面での課題が存在することは上記のとおりであるが、ダイマーペプチド等のペプチド分子の活性の観点からも、より有用な短鎖リンカーについて切望されているところである。
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００５】
上述のとおり、ダイマーペプチド等のペプチド分子の製造において、従来の化学合成手法では、操作が簡便ではなく、必要な費用も高額であった。
そこで、本発明の一態様では、ダイマーペプチド等のペプチド分子を、従来の化学合成手法と比較して簡便かつ安価に製造する方法を提供することを目的とする。
【０００６】
２つのペプチド鎖を連結する短鎖リンカーとして、ダイマーペプチド等のペプチド分子の活性の観点から、より有用な短鎖リンカーが望まれることは上記のとおりである。
そこで、本発明の一態様では、特定の短鎖リンカーを含む良好な活性を有するダイマーペプチド等のペプチド分子を提供することを目的とする。
【課題を解決するための手段】
【０００７】
本発明は、例えば、以下の態様を含み得る。
〔１〕（I）第１の生理活性ペプチド部位と、
（II）４９個以下のアミノ酸残基からなるリンカー部位と、
（III）前記リンカー部位を介して前記第１の生理活性ペプチド部位とは反対側に位置する第２の生理活性ペプチド部位と
を含むペプチド分子であって、
前記第１の生理活性ペプチド部位と前記第２の生理活性ペプチド部位が、互いに同じであっても異なっていてもよく、
前記リンカー部位のアミノ酸配列の少なくとも９０％がアラニン（A）、プロリン（P）及びセリン（S）から選択されるアミノ酸残基からなる、前記ペプチド分子。
〔２〕前記第１の生理活性ペプチド部位が環状ペプチドを構成している、及び／又は前記第２の生理活性ペプチド部位が環状ペプチドを構成している、前記〔１〕に記載のペプチド分子。
〔３〕前記第１の生理活性ペプチド部位が、ジスルフィド結合により環状構造が形成された環状ペプチドを構成している、及び／又は前記第２の生理活性ペプチド部位が、ジスルフィド結合により環状構造が形成された環状ペプチドを構成している、前記〔１〕又は〔２〕に記載のペプチド分子。
〔４〕前記第１の生理活性ペプチド部位と前記第２の生理活性ペプチド部位が、それぞれ、c-Metタンパク質に結合する環状ペプチドを構成しており、互いに同じであっても異なっていてもよい、前記〔１〕～〔３〕のいずれか１項に記載のペプチド分子。
〔５〕前記環状ペプチドが、以下の（a）～（i）から選択されるアミノ酸配列を含む、ジスルフィド結合により環状構造を形成している環状ペプチドである、前記〔４〕に記載のペプチド分子。
（a）CYRQFNRRTHEVWNLDC（配列番号：１）；
（b）CRQFNRRTHEVWNLDC（配列番号：２）；
（c）CYWYYAWDQTYKAFPC（配列番号：３）；
（d）CWYYAWDQTYKAFPC（配列番号：４）；
（e）CYISWNEFNSPNWRFITC（配列番号：５）；
（f）CISWNEFNSPNWRFITC（配列番号：６）；
（g）（a）～（f）のいずれかのアミノ酸配列において、システイン残基以外の１又は２個のアミノ酸残基が置換、欠失又は付加されており、かつc-Metタンパク質に結合するペプチド；
（h）（a）～（f）のいずれかのアミノ酸配列と90％以上の配列同一性を有し、但し両端のシステイン残基を有しているアミノ酸配列からなり、かつc-Metタンパク質に結合するペプチド；及び
（i）（a）～（h）のいずれかのアミノ酸配列において、両端のシステイン残基以外の少なくとも１つのアミノ酸が修飾されているペプチド（アミノ酸の修飾は、リン酸化、メチル化、アセチル化、アデニリル化、ADPリボシル化又は糖鎖付加である。）
〔６〕前記第１の生理活性ペプチド部位と前記第２の生理活性ペプチド部位が、それぞれ、エリスロポエチン受容体に結合する環状ペプチドを構成しており、互いに同じであっても異なっていてもよい、前記〔１〕～〔３〕のいずれか１項に記載のペプチド分子。
〔７〕前記環状ペプチドが、以下の（j）～（n）から選択されるアミノ酸配列を含む、ジスルフィド結合により環状構造を形成している環状ペプチドである、前記〔６〕に記載のペプチド分子。
（j）GGLYACHMGPMTWVCQPLRG（配列番号：６５）；
（k）CISWNEFNSPNWRFITC（配列番号：６６）；
（l）（j）又は（k）のアミノ酸配列において、システイン残基以外の１又は２個のアミノ酸残基が置換、欠失又は付加されており、かつエリスロポエチン受容体に結合するペプチド；
（m）（j）又は（k）のいずれかのアミノ酸配列と90％以上の配列同一性を有し、但しシステイン残基を（j）又は（k）におけるそのままの位置で有しているアミノ酸配列からなり、かつエリスロポエチン受容体に結合するペプチド；及び
（n）（j）～（m）のいずれかのアミノ酸配列において、システイン残基以外の少なくとも１つのアミノ酸が修飾されているペプチド（アミノ酸の修飾は、リン酸化、メチル化、アセチル化、アデニリル化、ADPリボシル化又は糖鎖付加である。）
〔８〕前記第１の生理活性ペプチド部位と前記第２の生理活性ペプチド部位が、それぞれ、トロンボポエチン受容体に結合する生理活性ペプチドからなり、互いに同じであっても異なっていてもよい、前記〔１〕～〔３〕のいずれか１項に記載のペプチド分子。
〔９〕前記生理活性ペプチドが、以下の（o）～（u）から選択されるアミノ酸配列を含む、前記〔８〕に記載のペプチド分子。
（o）IEGPTLRQWLAARA（配列番号：６７）；
（p）GGCADGPTLREWISFCGG（配列番号：６８）；
（q）GGCTLREWLHGGFCGG（配列番号：６９）；
（r）LAIEGPTLRQWLHGNGRDT（配列番号：７０）；
（s）（o）～（r）のいずれかのアミノ酸配列において、システイン残基以外の１又は２個のアミノ酸残基が置換、欠失又は付加されており、かつトロンボポエチン受容体に結合するペプチド；
（t）（o）～（r）のいずれかのアミノ酸配列と90％以上の配列同一性を有し、但し（p）又は（q）を基準とする場合にはシステイン残基を（p）又は（q）におけるそのままの位置で有しているアミノ酸配列からなり、かつトロンボポエチン受容体に結合するペプチド；及び
（u）（o）～（t）のいずれかのアミノ酸配列において、システイン残基以外の少なくとも１つのアミノ酸が修飾されているペプチド（アミノ酸の修飾は、リン酸化、メチル化、アセチル化、アデニリル化、ADPリボシル化又は糖鎖付加である。）
〔１０〕前記リンカー部位（II）と隣接しない位置で、機能性修飾部位を更に含む、前記〔１〕～〔９〕のいずれか１項に記載のペプチド分子。
〔１１〕前記リンカー部位（II）が第１のリンカー部位であり、
前記第２の生理活性ペプチド部位の、前記第１のリンカー部位とは反対側に第２のリンカー部位を更に含み、
前記第２のリンカー部位を介して前記第２の生理活性ペプチド部位とは反対側に位置する第３の生理活性ペプチド部位を更に含み、
前記第３の生理活性ペプチド部位が、前記第１の生理活性ペプチド部位及び／又は前記第２の生理活性ペプチド部位と同じであっても異なっていてもよく、
前記第２のリンカー部位が、４９個以下のアミノ酸残基からなり、そのアミノ酸配列の少なくとも９０％がアラニン（A）、プロリン（P）及びセリン（S）から選択されるアミノ酸残基からなり、前記第１のリンカー部位と同じであっても異なっていてもよい、前記〔１〕～〔１０〕のいずれか１項に記載のペプチド分子。
〔１２〕前記リンカー部位（II）が、AP、AAP、AS、ASP及びASSからなる群から選択されるアミノ酸配列を２つ以上繰り返して含み、かつ第２のリンカー部位が存在する場合には、当該第２のリンカー部位が、AP、AAP、AS、ASP及びASSからなる群から選択されるアミノ酸配列を２つ以上繰り返して含む、前記〔１〕～〔１１〕のいずれか１項に記載のペプチド分子。
〔１３〕ペプチド分子の製造方法であって、
前記ペプチド分子をコードするポリヌクレオチドを含む宿主細胞において前記ポリヌクレオチドを発現させること、又は前記ペプチド分子をコードするポリヌクレオチドを無細胞発現系において発現させることにより、前記ペプチド分子を生成する工程、
を含み、
前記ペプチド分子が、（I）第１の生理活性ペプチド部位と、（II）アミノ酸残基からなるリンカー部位と、（III）前記リンカー部位を介して前記第１の生理活性ペプチド部位とは反対側に位置する、第２の生理活性ペプチド部位及び／又は少なくとも１つのアミノ酸残基からなる付加アミノ酸配列とを含み、
前記第１の生理活性ペプチド部位と前記第２の生理活性ペプチド部位が、それぞれ、分子量10,000以下であり、かつ５０個以下のアミノ酸残基からなり、互いに同じであっても異なっていてもよく、
前記付加アミノ酸配列が、分子量10,000以下であり、かつ５０個以下のアミノ酸残基からなる、前記製造方法。
〔１４〕前記第１の生理活性ペプチド部位が環状ペプチドを構成している、及び／又は前記第２の生理活性ペプチド部位が環状ペプチドを構成している、前記〔１３〕に記載の製造方法。
【０００８】
本発明の一実施態様によれば、ダイマーペプチド等のペプチド分子を、従来の化学合成手法と比較して簡便かつ安価に製造することができる。
本発明の一実施態様によれば、第１のペプチドのＣ末端がリンカーに結合し、第２のペプチドのＮ末端がリンカーに結合するようなダイマーペプチドの効率的な合成を行うことができる。
本発明の一実施態様によれば、良好な活性を有するダイマーペプチドを提供することができる。
【図面の簡単な説明】
【０００９】
C. glutamicumにおけるダイマーペプチド（FBP-PAS）の分泌発現を示す、SDS-ポリアクリルアミド電気泳動の結果である。レーン１は、マーカー（XL-Ladder Broad、APRO science）であり、レーン２～５は、pPK10_TorAss-FBP-PASを用いたもの、レーン６は、pPK10（空ベクター）を用いたものである。
MALDI-TOF-MSによるダイマーペプチド（FBP-PAS）の測定結果である。図中の分子模式図は、FBP-PASダイマーペプチドを示し、中央部分（色なし）がPASを表し、その両側部分（色付き）がFBPを表す。
モノマーペプチド（FBP）とダイマーペプチド（FBP-PAS）の活性評価を示すグラフである。縦軸は相対的受容体活性を表し、横軸はbFGF濃度を表す。図中の分子模式図において、色なし部分がPASを表し、色付き部分がFBPを表す。
C. glutamicumにおけるダイマーペプチド（HGF-PAS）の分泌発現を示す、SDS-ポリアクリルアミド電気泳動の結果である。レーン１は、マーカー（XL-Ladder Broad、APRO science）であり、レーン２～５は、pPK10_TorAss-PAS-aMD4-PEG11を用いたもの、レーン６～９は、pPK10_TorAss-PAS-aMD4dY-PEG11を用いたもの、レーン１０～１３は、pPK10_TorAss-PAS-aMD4-PEG3を用いたもの、レーン１４は、pPK10（空ベクター）を用いたものである。
C. glutamicumにおけるダイマーペプチド（HGF-PAS）の分泌発現を示す、SDS-ポリアクリルアミド電気泳動の結果である。レーン１は、マーカー（XL-Ladder Broad、APRO science）であり、レーン２～５は、pPK4_CspBss-AET-PAS-aMD4-PEG11を用いたもの、レーン６～９は、pPK4_CspBss-AET-PAS-aMD4dY-PEG11を用いたもの、レーン１０～１３は、pPK4_CspBss-AET-PAS-aMD4-PEG3を用いたもの、レーン１４は、pPK4（空ベクター）を用いたものである。
MALDI-TOF-MSによるダイマーペプチド（HGF-PAS）の測定結果である。
HGFとダイマーペプチド（HGF-PAS）の活性評価を示すグラフである。縦軸は相対的受容体活性を表し、横軸は濃度を表す。
HGFとダイマーペプチド（HGF-PAS）の活性評価を示すグラフである。縦軸は相対的受容体活性を表し、横軸は濃度を表す。
HGFとダイマーペプチド（HGF-PAS）の活性評価を示すグラフである。縦軸は相対的受容体活性を表し、横軸はHGFについて濃度を表し、ダイマーペプチド（HGF-PAS）については、活性評価に供した培地に対し10倍希釈のダイマーペプチド（HGF-PAS）を含む培養上清を用いたものである。
Proteome Profiler Human Phospho-RTK Array Kit（R&D Systems）を用いて、ダイマーペプチド（HGF-PAS）の受容体チロシンキナーゼ（RTK）特異性を評価した図である。ダイマーペプチド（HGF-PAS）はMet（HGF受容体）特異性を示すことが確認されている。
Proteome Profiler Human Phospho-RTK Array Kit（R&D Systems）の各アレイを示す図である。
HGFとダイマーペプチド（HGF-PAS）の細胞増殖促進活性の評価を示すグラフである。縦軸は生細胞数を表す。
HGFとダイマーペプチド（HGF-PAS）の細胞遊走活性の評価における顕微鏡写真図である。
HGFとダイマーペプチド（HGF-PAS）の細胞遊走活性の評価を示すグラフである。縦軸は相対的移動効率を表す。
HGFとダイマーペプチド（HGF-PAS）の創傷治癒効果の評価において細胞観察装置により撮影した写真図である。
HGFとダイマーペプチド（HGF-PAS）の創傷治癒効果の評価を示すグラフである。縦軸は創傷治癒速度を表す。
HGFとダイマーペプチド（HGF-PAS）の管状構造形成効果の評価における顕微鏡写真図である。スケールバーは、500 μmを表す。
C. glutamicumにおけるヘテロダイマーペプチド（HGF-PAS）の分泌発現を示す、SDS-ポリアクリルアミド電気泳動の結果である。レーン１は、マーカー（XL-Ladder Broad、APRO science）であり、レーン２～５は、pPK4_CspBss-AET-PAS-aMD4_aMD5-PEG11を用いたもの、レーン６は、pPK4（空ベクター）を用いたものである。
MALDI-TOF-MSによるヘテロダイマーペプチド（HGF-PAS）の測定結果である。
C. glutamicumにおけるダイマーペプチド（HGF-PAS、HGF-GS）の分泌発現を示す、SDS-ポリアクリルアミド電気泳動の結果である。レーン１は、マーカー（XL-Ladder Broad、APRO science）であり、レーン２は、pPK4_CspBss-AET-aMD4dY-GS15を用いたもの、レーン３は、pPK4_CspBss-AET-aMD4dY-GS22を用いたもの、レーン４は、pPK4_CspBss-AET-aMD4dY-PAS8を用いたもの、レーン５は、pPK4_CspBss-AET-PAS-aMD4dY-PEG11を用いたもの、レーン６は、pPK4_CspBss-AET-aMD4dY-PAS49を用いたもの、レーン７は、pPK4_CspBss-AET-aMD4dY-PAS100を用いたもの、レーン８は、pPK4_CspBss-AET-aMD4dY-PAS200を用いたもの、レーン９は、pPK4（空ベクター）を用いたものである。
LC-MSによるダイマーペプチド（HGF-GS）の測定結果である。Calcは理論値を表し、Obsは実測値を表す。
LC-MSによるダイマーペプチド（HGF-PAS）の測定結果である。Calcは理論値を表し、Obsは実測値を表す。
LC-MSによるダイマーペプチド（HGF-PAS）の測定結果である。Calcは理論値を表し、Obsは実測値を表す。
LC-MSによるダイマーペプチド（HGF-PAS）の測定結果である。Calcは理論値を表し、Obsは実測値を表す。
LC-MSによるダイマーペプチド（HGF-PAS）の測定結果である。Calcは理論値を表し、Obsは実測値を表す。
LC-MSによるダイマーペプチド（HGF-PAS）の測定結果である。Calcは理論値を表し、Obsは実測値を表す。
HGFとダイマーペプチド（HGF-PAS）の活性評価を示すグラフである。縦軸は相対的受容体活性を表し、横軸は、HGFに関しては濃度を表し、ダイマーペプチド（HGF-PAS）に関しては、活性評価に供した培地に対するダイマーペプチド（HGF-PAS）を含む培養上清の希釈率を表す。横軸におけるPAS8、PAS22、PAS49、PAS100、及びPAS200は、それぞれ、AET-aMD4dY-PAS8、AET-aMD4dY-PAS22（AET-PAS-aMD4dY-PEG11と同じである。）、AET-aMD4dY-PAS49、AET-aMD4dY-PAS100、及びAET-aMD4dY-PAS200を表す。Emptyは空ベクターを用いた結果であり、ダイマーペプチドを含む培養上清を用いた場合と同様に活性評価に供した培地に対する希釈率を表す。
HGFとダイマーペプチド（HGF-GS）の活性評価を示すグラフである。縦軸は相対的受容体活性を表し、横軸は、HGFに関しては濃度を表し、ダイマーペプチド（HGF-GS）に関しては、活性評価に供した培地に対するダイマーペプチド（HGF-PAS）を含む培養上清の希釈率を表す。横軸におけるGS15及びGS22は、それぞれ、AET-aMD4dY-GS15及びAET-aMD4dY-GS22を表す。Emptyは空ベクターを用いた結果であり、ダイマーペプチドを含む培養上清を用いた場合と同様に活性評価に供した培地に対する希釈率を表す。
C. glutamicumにおけるダイマーペプチド（HGF-PAS）の分泌発現を示す、SDS-ポリアクリルアミド電気泳動の結果である。レーン１は、マーカー（XL-Ladder Broad、APRO science）であり、レーン２～５は、pPK4_CspBss-AET-aMD4dY-PAS22-PAS200を用いたもの、レーン６は、pPK4（空ベクター）を用いたものである。
LC-MSによるダイマーペプチド（HGF-PAS）の測定結果である。Calcは理論値を表し、Obsは実測値を表す。
HGFとダイマーペプチド（HGF-PAS）の活性評価を示すグラフである。縦軸は相対的受容体活性を表し、横軸は、HGFに関しては濃度を表し、ダイマーペプチド（HGF-PAS）に関しては、活性評価に供した培地に対するダイマーペプチド（HGF-PAS）を含む培養上清の希釈率を表す。横軸におけるPAS22-PAS200は、AET-aMD4dY-PAS22-PAS200を表す。Emptyは空ベクターを用いた結果であり、ダイマーペプチドを含む培養上清を用いた場合と同様に活性評価に供した培地に対する希釈率を表す。
C. glutamicumにおけるダイマーペプチド（EPO-PAS）の分泌発現を示す、SDS-ポリアクリルアミド電気泳動の結果である。レーン１は、マーカー（XL-Ladder Broad、APRO science）であり、レーン２～５は、pPK4_CspBss-EPO-PAS8を用いたもの、レーン６～９は、pPK4_CspBss-EPO-PAS22を用いたもの、レーン１０～１３は、pPK4_CspBss-AET-EPO-PAS8を用いたもの、レーン１４～１７は、pPK4_CspBss-AET-EPO-PAS22を用いたもの、レーン１８は、pPK4（空ベクター）を用いたものである。
LC-MSによるダイマーペプチド（EPO-PAS）の測定結果である。Calcは理論値を表し、Obsは実測値を表す。
LC-MSによるダイマーペプチド（EPO-PAS）の測定結果である。Calcは理論値を表し、Obsは実測値を表す。
rhEPOとダイマーペプチド（EPO-PAS）の活性評価を示すグラフである。縦軸は相対的受容体活性を表し、横軸は濃度を表す。
モノマーペプチドであるEMP35の活性評価を示すグラフである。縦軸は相対的受容体活性を表し、横軸は濃度を表す。
C. glutamicumにおけるダイマーペプチド（TPO-PAS）の分泌発現を示す、SDS-ポリアクリルアミド電気泳動の結果である。レーン１は、マーカー（XL-Ladder Broad、APRO science）であり、レーン２～５は、pPK4_CspBss-AET-TPO1-PAS8を用いたもの、レーン６～９は、pPK4_CspBss-TPO2-PAS8を用いたもの、レーン１０～１３は、pPK4_CspBss-AET-TPO2-PAS8を用いたもの、レーン１４は、pPK4（空ベクター）を用いたものである。
LC-MSによるダイマーペプチド（TPO-PAS）の測定結果である。Calcは理論値を表し、Obsは実測値を表す。
LC-MSによるダイマーペプチド（TPO-PAS）の測定結果である。Calcは理論値を表し、Obsは実測値を表す。
LC-MSによるダイマーペプチド（TPO-PAS）の測定結果である。Calcは理論値を表し、Obsは実測値を表す。
rhTPOとダイマーペプチド（TPO-PAS）のチロシンリン酸化レベルの評価を示すグラフである。上図のとおり検出されたドット発光強度を定量し、その定量結果を下図のグラフにおいて相対的チロシンリン酸化レベルで示している。縦軸は相対的チロシンリン酸化レベルを表し、横軸は、rhTPOに関しては濃度を表し、ダイマーペプチド（TPO-PAS）に関しては、活性評価に供した培地に対するダイマーペプチド（TPO-PAS）を含む培養上清の希釈率を表す。Empty CFBは空ベクターを用いた場合の上清についての結果である。MockはPBS添加群を表す。
rhTPOとダイマーペプチド（TPO-PAS）の細胞活性化能評価を示すグラフである。上図のとおり検出されたドット発光強度を定量し、その定量結果を下図のグラフにおいて示している。縦軸はドット発光強度を表し、横軸は、rhTPOに関しては濃度を表し、ダイマーペプチド（TPO-PAS）に関しては、活性評価に供した培地に対するダイマーペプチド（TPO-PAS）を含む培養上清の希釈率を表す。MockはPBS添加群を表す。
Proteome Profiler Human Phospho-Kinase Array Kit（R&D Systems）を用いて、rhTPOとダイマーペプチド（TPO-PAS）のシグナル活性化特性を評価した図である。ダイマーペプチド（TPO-PAS）については、活性評価に供した培地に対するダイマーペプチド（TPO-PAS）を含む培養上清の希釈率が示されている。MockはPBS添加群を表す。
Proteome Profiler Human Phospho-Kinase Array Kit（R&D Systems）を用いて測定したrhTPOとダイマーペプチド（TPO-PAS）のリン酸化能を定量的に示したグラフである。縦軸は相対的ドット発光強度を表し、横軸は、活性化された分子を表す。ダイマーペプチド（TPO-PAS）については、活性評価に供した培地に対するダイマーペプチド（TPO-PAS）を含む培養上清の希釈率が示されている。MockはPBS添加群を表す。
C. glutamicumにおけるヘテロダイマーペプチド（VEGFR_D2-PAS）の分泌発現を示す、SDS-ポリアクリルアミド電気泳動の結果である。レーン１は、マーカー（XL-Ladder Broad、APRO science）であり、レーン２及び３は、それぞれ、pPK4_CspBss-VEGFR_D2-PAS16を用いた場合の培養上清についてのもの及び菌体を含む培養液全体についてのもの、レーン４及び５は、それぞれ、pPK4_CspBss-VEGFR_D2-PAS16を用いた場合であって、菌体を含む沈殿画分にTris-HClを添加後の上清画分についてのもの及び菌体を含む混合液全体についてのもの、レーン６及び７は、それぞれ、pPK4_CspBss-VEGFR_D2-PAS16を用いた場合であって、菌体を含む沈殿画分に尿素処理液（0.5M尿素）を添加後の上清画分についてのもの及び菌体を含む混合液全体についてのもの、レーン８及び９は、それぞれ、pPK4_CspBss-VEGFR_D2-PAS16を用いた場合であって、菌体を含む沈殿画分に尿素処理液（1.0M尿素）を添加後の上清画分についてのもの及び菌体を含む混合液全体についてのものである。
LC-MSによるヘテロダイマーペプチド（VEGFR_D2-PAS）の測定結果である。Calcは理論値を表し、Obsは実測値を表す。
ヘテロダイマーペプチド（VEGFR_D2-PAS）とモノマーペプチドであるP3及びPm4のVEGF阻害能の評価を示すグラフである。縦軸は相対的VEGF活性（相対的受容体活性）を表し、横軸は濃度を表す。
C. glutamicumにおけるダイマーペプチド（EPO-PAS、EPO-GS）の分泌発現を示す、SDS-ポリアクリルアミド電気泳動の結果である。レーン１は、マーカー（XL-Ladder Broad、APRO science）であり、レーン２～５は、pPK4_CspBss-AET-EPO-PAS49を用いたもの、レーン６～９は、pPK4_CspBss-AET-EPO-PAS49-bを用いたもの、レーン１０～１３は、pPK4_CspBss-AET-EPO-PAS100を用いたもの、レーン１４～１７は、pPK4_CspBss-AET-EPO-PAS100-bを用いたもの、レーン１８～２１は、pPK4_CspBss-AET-EPO-GS8を用いたもの、レーン２２～２５は、pPK4_CspBss-AET-EPO-GS22を用いたもの、レーン２６は、pPK4（空ベクター）を用いたものである。
LC-MSによるダイマーペプチド（EPO-GS）の測定結果である。Calcは理論値を表し、Obsは実測値を表す。
LC-MSによるダイマーペプチド（EPO-GS）の測定結果である。Calcは理論値を表し、Obsは実測値を表す。
LC-MSによるダイマーペプチド（EPO-PAS）の測定結果である。Calcは理論値を表し、Obsは実測値を表す。
LC-MSによるダイマーペプチド（EPO-PAS）の測定結果である。Calcは理論値を表し、Obsは実測値を表す。
LC-MSによるダイマーペプチド（EPO-PAS）の測定結果である。Calcは理論値を表し、Obsは実測値を表す。
LC-MSによるダイマーペプチド（EPO-PAS）の測定結果である。Calcは理論値を表し、Obsは実測値を表す。
ダイマーペプチド（EPO-PAS、EPO-GS）の活性評価を示すグラフである。縦軸は相対的受容体活性を表し、横軸は濃度を表す。
ダイマーペプチド（EPO-PAS、EPO-GS）の活性評価を示すグラフである。縦軸は相対的受容体活性を表し、横軸は濃度を表す。
ダイマーペプチド（EPO-PAS）の活性評価を示すグラフである。縦軸は相対的受容体活性を表し、横軸は濃度を表す。
C. glutamicumにおけるダイマーペプチド（EPO-PAS）の分泌発現を示す、SDS-ポリアクリルアミド電気泳動の結果である。レーン１は、マーカー（XL-Ladder Broad、APRO science）であり、レーン２～５は、pPK4_CspBss-AET-EPO-PAS22-PAS200を用いたもの、レーン６～９は、pPK4_CspBss-AET-EPO-PAS22-PAS600を用いたもの、レーン１０は、pPK4（空ベクター）を用いたものである。
LC-MSによるダイマーペプチド（EPO-PAS）の測定結果である。Calcは理論値を表し、Obsは実測値を表す。
LC-MSによるダイマーペプチド（EPO-PAS）の測定結果である。Calcは理論値を表し、Obsは実測値を表す。
ダイマーペプチド（EPO-PAS）の活性評価を示すグラフである。縦軸は相対的受容体活性を表し、横軸は濃度を表す。
MALDI-TOF-MSによるダイマーペプチド（HGF-PAS）の測定結果である。
MALDI-TOF-MSによるダイマーペプチド（HGF-PAS）の測定結果である。
MALDI-TOF-MSによるダイマーペプチド（HGF-PAS）の測定結果である。
MALDI-TOF-MSによるダイマーペプチド（EPO-PAS）の測定結果である。
MALDI-TOF-MSによるダイマーペプチド（EPO-PAS）の測定結果である。
MALDI-TOF-MSによるダイマーペプチド（EPO-PAS）の測定結果である。
MALDI-TOF-MSによるダイマーペプチド（VEGFR_D2-PAS）の測定結果である。
ダイマーペプチド（HGF-PAS）の活性評価を示すグラフである。縦軸は相対的受容体活性を表し、横軸は、活性評価に供した培地に対するダイマーペプチド（HGF-PAS）を含む無細胞発現系の反応液の希釈倍率を表す。Blankは無細胞発現において発現用DNAを用いない場合の結果である。
ダイマーペプチド（EPO-PAS）の活性評価を示すグラフである。縦軸は相対的受容体活性を表し、横軸は濃度を表す。
ヘテロダイマーペプチド（VEGFR_D2-PAS）のVEGF阻害能の評価を示すグラフである。縦軸は相対的VEGF活性（相対的受容体活性）を表し、横軸は濃度を表す。
ヘテロダイマーペプチド（VEGFR_D2-PAS、VEGFR_D2-GS）のVEGF阻害能の評価を示すグラフである。縦軸は相対的VEGF活性（相対的受容体活性）を表し、横軸は濃度を表す。
C. glutamicumにおけるダイマーペプチド及びトリマーペプチド（HGF-PAS）の分泌発現を示す、SDS-ポリアクリルアミド電気泳動の結果である。レーン１は、マーカー（XL-Ladder Broad、APRO science）であり、レーン２～５は、pPK4_CspBss-AET-aMD4dY-PAS22-Trimerを用いたもの、レーン６は、pPK4_CspBss-AET-aMD4dY-PAS22を用いたもの、レーン７は、pPK4（空ベクター）を用いたものである。
LC-MSによるトリマーペプチド（HGF-PAS）の測定結果である。Calcは理論値を表し、Obsは実測値を表す。
ダイマーペプチド及びトリマーペプチド（HGF-PAS）の活性評価を示すグラフである。縦軸は相対的受容体活性を表し、横軸は濃度を表す。
HGF、ダイマーペプチド（HGF-PAS）、及びモノマーペプチドであるaMD4dYの活性評価を示すグラフである。縦軸は相対的受容体活性を表し、横軸は濃度を表す。
C. glutamicumにおけるヘテロダイマーペプチド（VEGFR_D2-PAS、VEGFR_D2-GS）の分泌発現を示す、SDS-ポリアクリルアミド電気泳動の結果である。レーン１は、マーカー（XL-Ladder Broad、APRO science）であり、レーン２～５は、pPK4_CspBss-VEGFR_D2-PAS49を用いたもの、レーン６～９は、pPK4_CspBss-VEGFR_D2-PAS49-bを用いたもの、レーン１０～１３は、pPK4_CspBss-VEGFR_D2-PAS100を用いたもの、レーン１４～１７は、pPK4_CspBss-VEGFR_D2-PAS100-bを用いたもの、レーン１８～２１は、pPK4_CspBss-VEGFR_D2-GS16を用いたもの、レーン２２は、pPK4（空ベクター）を用いたものである。
LC-MSによるヘテロダイマーペプチド（VEGFR_D2-GS）の測定結果である。Calcは理論値を表し、Obsは実測値を表す。
LC-MSによるヘテロダイマーペプチド（VEGFR_D2-PAS）の測定結果である。Calcは理論値を表し、Obsは実測値を表す。
LC-MSによるヘテロダイマーペプチド（VEGFR_D2-PAS）の測定結果である。Calcは理論値を表し、Obsは実測値を表す。
LC-MSによるヘテロダイマーペプチド（VEGFR_D2-PAS）の測定結果である。Calcは理論値を表し、Obsは実測値を表す。
ヘテロダイマーペプチド（VEGFR_D2-PAS、VEGFR_D2-GS）のVEGF阻害能の評価を示すグラフである。縦軸は相対的VEGF活性（相対的受容体活性）を表し、横軸は濃度を表す。
ヘテロダイマーペプチド（VEGFR_D2-PAS）のVEGF阻害能の評価を示すグラフである。縦軸は相対的VEGF活性（相対的受容体活性）を表し、横軸は濃度を表す。
C. glutamicumにおけるダイマーペプチド（TPO-PAS、TPO-GS）の分泌発現を示す、SDS-ポリアクリルアミド電気泳動の結果である。レーン１は、マーカー（XL-Ladder Broad、APRO science）であり、レーン２～５は、pPK4_CspBss-TPO2-PAS49を用いたもの、レーン６～９は、pPK4_CspBss-TPO2-PAS49-bを用いたもの、レーン１０～１３は、pPK4_CspBss-TPO2-PAS100を用いたもの、レーン１４～１７は、pPK4_CspBss-TPO2-PAS100-bを用いたもの、レーン１８～２１は、pPK4_CspBss-TPO2-GS8を用いたもの、レーン２２は、pPK4（空ベクター）を用いたものである。
LC-MSによるダイマーペプチド（TPO-GS）の測定結果である。Calcは理論値を表し、Obsは実測値を表す。
LC-MSによるダイマーペプチド（TPO-PAS）の測定結果である。Calcは理論値を表し、Obsは実測値を表す。
LC-MSによるダイマーペプチド（TPO-PAS）の測定結果である。Calcは理論値を表し、Obsは実測値を表す。
LC-MSによるダイマーペプチド（TPO-PAS）の測定結果である。Calcは理論値を表し、Obsは実測値を表す。
LC-MSによるダイマーペプチド（TPO-PAS）の測定結果である。Calcは理論値を表し、Obsは実測値を表す。
Phospho-CREB (Ser133) and Total CREB ELISA kit（RayBio社）を用いて測定したrhTPOとダイマーペプチド（TPO-PAS、TPO-GS）のリン酸化能を定量的に示したグラフである。縦軸は相対的CREBリン酸化レベルを表し、横軸は、活性化された分子を表す。MockはPBS添加群を表す。
【発明を実施するための形態】
【００１０】
本発明の一実施態様は、ペプチド分子に関する。このようなペプチド分子は、
（I）第１の生理活性ペプチド部位と、
（II）４９個以下のアミノ酸残基からなるリンカー部位と、
（III）前記リンカー部位を介して前記第１の生理活性ペプチド部位とは反対側に位置する第２の生理活性ペプチド部位と
を含むペプチド分子であって、
前記第１の生理活性ペプチド部位と前記第２の生理活性ペプチド部位が、互いに同じであっても異なっていてもよく、
前記リンカー部位のアミノ酸配列の少なくとも９０％がアラニン（A）、プロリン（P）及びセリン（S）から選択されるアミノ酸残基からなる、ペプチド分子である。
本発明のペプチド分子の一実施態様において、リンカー部位のＮ末端側に第１の生理活性ペプチド部位を含み、リンカー部位のＣ末端側に第２の生理活性ペプチド部位を含んでもよく、リンカー部位のＣ末端側に第１の生理活性ペプチド部位を含み、リンカー部位のＮ末端側に第２の生理活性ペプチド部位を含んでもよい。また、本発明のペプチド分子の一実施態様において、第１の生理活性ペプチド部位及び／又は第２の生理活性ペプチド部位のＮ末端側及び／又はＣ末端側、或いはリンカー部位との間において、第１の生理活性ペプチド及び第２の生理活性ペプチドの機能を阻害しない範囲内で任意のアミノ酸配列を含み得る。このような任意のアミノ酸配列としては、例えば、宿主細胞におけるペプチド分子の発現や分泌を高めるのに有用な配列や、単に長さを調節する目的のもの（１個、２個、３個、又は１～５個のＧｌｙ等）を用い得る。
本発明のペプチド分子において、各アミノ酸は、L-アミノ酸であってもD-アミノ酸であってもよく、天然型であっても非天然型であってもよい。また、本発明のペプチド分子において、各アミノ酸は、好ましくはα－、β－またはγ－アミノ酸であり、より好ましくはα－アミノ酸である。
（【００１１】以降は省略されています）

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