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公開番号2025118067
公報種別公開特許公報(A)
公開日2025-08-13
出願番号2024013155
出願日2024-01-31
発明の名称変異型アスパラギン酸キナーゼHom3によりスレオニンを高生産する酵母
出願人武蔵精密工業株式会社,国立大学法人奈良先端科学技術大学院大学
代理人個人
主分類C12N 15/54 20060101AFI20250805BHJP(生化学;ビール;酒精;ぶどう酒;酢;微生物学;酵素学;突然変異または遺伝子工学)
要約【課題】変異型アスパラギン酸キナーゼHom3によりスレオニンを高生産する酵母を用いてスレオニンを生産する方法を提供する。
【解決手段】(a)特定のアミノ酸配列、又はSaccaromyces属に属する酵母のHOM3遺伝子にコードされたアミノ酸配列であってAla462Thr置換を有するアミノ酸配列、(b)(a)のアミノ酸配列に対し、1又は数個のアミノ酸が欠失、置換若しくは付加されたアミノ酸配列であって、Hom3の機能を有するアミノ酸配列、(c)(a)のアミノ酸配列と90%以上の配列同一性を備え、且つ(a)の452位-461位及び463位-472位のアミノ酸配列が特定の配列と一致し、Hom3の機能を有するアミノ酸配列であり、(a)～(c)のAla462Thr置換を有する変異型アスパラギン酸キナーゼHom3を発現させた酵母を用いて、スレオニンを生産する方法である。
【選択図】図2
特許請求の範囲【請求項１】
以下(a)～(c)のアミノ酸配列を持つAla462Thr置換を有する変異型アスパラギン酸キナーゼHom3を発現させた酵母を用いて、スレオニンを生産する方法、
(a)配列番号１のアミノ酸配列、またはSaccaromyces属に属する酵母のHOM3遺伝子にコードされたアミノ酸配列であってAla462Thr置換を有するアミノ酸配列、
(b)上記(a)のアミノ酸配列に対し、１又は数個のアミノ酸が欠失、置換若しくは付加されたアミノ酸配列であって、Hom3の機能を有するアミノ酸配列、
(c)上記(a)のアミノ酸配列と90％以上の配列同一性を備え、かつ上記(a)の452位－461位及び463位－472位のアミノ酸配列が配列番号１と一致し、Hom3の機能を有するアミノ酸配列。
続きを表示（約 820 文字）【請求項２】
以下(a)～(c)のアミノ酸配列を持つAla462Thr置換を有する変異型アスパラギン酸キナーゼHom3を発現させた酵母を含有する飲食品、
(a)配列番号１のアミノ酸配列、またはSaccaromyces属に属する酵母のHOM3遺伝子にコードされたアミノ酸配列であってAla462Thr置換を有するアミノ酸配列、
(b)上記(a)において、１又は数個のアミノ酸が欠失、置換若しくは付加されたアミノ酸配列であって、Hom3の機能を有するアミノ酸配列、
(c)上記(a)と90％以上の配列同一性を備え、かつ上記(a)の452位－461位及び463位－472位のアミノ酸配列が配列番号１と一致し、Hom3の機能を有するアミノ酸配列。
【請求項３】
以下(a)～(c)のアミノ酸配列を持つAla462Thr置換を有する変異型アスパラギン酸キナーゼHom3をコードする核酸、
(a)配列番号１のアミノ酸配列、またはSaccaromyces属に属する酵母のHOM3遺伝子にコードされたアミノ酸配列であってAla462Thr置換を有するアミノ酸配列をコードする核酸、
(b)上記(a)において、１又は数個のアミノ酸が欠失、置換若しくは付加されたアミノ酸配列であって、Hom3の機能を有するアミノ酸配列をコードする核酸、
(c)上記(a)と90％以上の配列同一性を備え、かつ上記(a)の452位－461位及び463位－472位のアミノ酸配列が配列番号１と一致し、Hom3の機能を有するアミノ酸配列をコードする核酸。
【請求項４】
前記核酸の配列が配列番号２に記載のものである核酸。
【請求項５】
請求項３または４に記載の核酸を発現可能な状態でコードする核酸を備え、前記変異型アスパラギン酸キナーゼHom3によりスレオニンを高生産する酵母。

発明の詳細な説明【技術分野】
【０００１】
本発明は、変異型アスパラギン酸キナーゼHom3によりスレオニンを高生産する酵母などに関する。
続きを表示（約 7,800 文字）【背景技術】
【０００２】
アミノ酸は、タンパク質合成の構成要素として生物にとって基本的な分子である。哺乳類はタンパク質を構成する20種類のうち、9種類のアミノ酸（必須アミノ酸）を生合成できないため、これらの必須アミノ酸は哺乳類にとって重要な栄養である。最近の研究によれば、必須アミノ酸の血中濃度の低下が軽度認知障害の方における認知症の発症と関連し、必須アミノ酸が脳の恒常性の維持に重要な役割を果たすことが報告されている。従って、必須アミノ酸の日々の摂取量を増加させることができれば、神経の変性過程を遅らせ得ると考えられる。しかし、加齢に伴う食欲減退と食品中の必須アミノ酸の含量が変動するために、高齢者が日常の食事から必須アミノ酸を効率的に摂取することは困難である。
酵母は、一般に安全と認識されている生物であり、栄養補助食品の生産に広く使用されている。このため、必須アミノ酸の多くを含有している酵母は、高齢者が適切な量の必須アミノ酸を摂取するのを助け、健康寿命の延長と生活の質の改善に寄与すると考えられる。
【０００３】
9種類の必須アミノ酸の中で、スレオニンは微生物を用いて工業的に生産されており、食品・飼料・化粧品・医薬品に広く使用されている。酵母では、スレオニンは5個の酵素反応を経て、ホモセリンを介し、アスパラギン酸から生合成される。図１（Ａ）に示すように、スレオニンの生合成経路は、ホモセリンからメチオニン生合成に分岐し、スレオニンはさらにイソロイシンに変換される。HOM3遺伝子によりコードされるアスパラギン酸キナーゼ（AK）はスレオニン生合成の最初の反応を触媒しており、ATPを用いたアスパラギン酸のリン酸化によりアスパラギン酸-4-リン酸を産生する。Hom3の酵素活性は最終産物であるスレオニンによってフィードバック阻害を受けており、この反応は出芽酵母におけるスレオニン生合成の律速段階となっている。
【０００４】
図１（Ｂ）に示すように、アミノ酸配列マップに依れば、Hom3はN末端触媒ドメイン（Catalytic domain）と2つのC末端制御ドメイン（ACT-1、ACT-2）からなる。このうちC末端制御ドメインは、アミノ酸代謝酵素のアロステリック制御に広く関与する、アスパラギン酸キナーゼ、コリスマートムターゼ、及びTyrA（ACT）ドメインの特徴的な二次構造を示している。各種微生物が持っているAKに関する研究によって、二つのACTドメインの相互作用によって阻害分子の結合部位が形成されることが分かった。スレオニンを蓄積する酵母変異株に関する研究によって、触媒ドメインのGlu279Ala置換とGlu282Asp置換、ACT-1ドメインのSer399Phe置換、ACT-2ドメインのGly452Asp置換のようなスレオニンの過剰生産に寄与するHOM3遺伝子のアミノ酸置換変異が同定されている。酵素分析によれば、これらのアミノ酸置換によってスレオニンによるフィードバック阻害に対する感受性が低下することで、スレオニンの生産増加に繋がることが明らかにされた。しかしながら、Glu279Ala置換及びGly452Asp置換を用いた解析によれば、これらのアミノ酸置換が酵素の反応動力学定数にも影響し、Hom3の触媒能の低下をもたらすことを示した。このことから、もし触媒能に影響がなく、スレオニンによるフィードバック阻害を受けないアミノ酸置換が存在すれば、酵母におけるスレオニン生産性を増加させるのに都合が良いことが理解される（非特許文献１、２、３）。
【先行技術文献】
【非特許文献】
【０００５】
Sato H, TakadoY, Toyoda S, Tsukamoto-Yasui M, Minatohara K, Takuwa H, Urushihata T, TakahashiM, Shimojo M, Ono M, Maeda J, Orihara A, Sahara N, Aoki I, Karakawa S, IsokawaM, Kawasaki N, Kawasaki M, Ueno S, Kanda M, Nishimura M, Suzuki K, Mitsui A,Nagao K, Kitamura A, Higuchi M.: Neurodegenerative processes accelerated byprotein malnutrition and decelerated by essential amino acids in a tauopathymouse model, Science Advances, 7, eabd5046, 2021
BareichDC, Wright GD.: Functionally important amino acids in Saccharomyces cerevisiaeaspartate kinase, Biochemical and Biophysical Research Communications, 311, 597-603,2003
Marina P,Martinez-Costa OH, Calderon IL, Aragon JJ.: Characterization of the aspartatekinase from Saccharomyces cerevisiae and of its interaction with threonine, Biochemicaland Biophysical Research Communications, 321, 584-591, 2004
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００６】
本研究は、上記課題に鑑みてなされたものであり、その目的は、変異型アスパラギン酸キナーゼHom3によりスレオニンを高生産する酵母を提供することにある。なお、本明細書において、アスパラギン酸キナーゼHom3は頭文字のみを大文字で表記しHom3と表記する。Hom3の遺伝子はHOM3と表記する。また、本発明のAla462Thr置換を有するアスパラギン酸キナーゼHom3は変異型Hom3と表記する。野生型のアスパラギン酸キナーゼHom3は野生型Hom3と表記する。
【課題を解決するための手段】
【０００７】
本発明者は、通常の変異誘発方法により二倍体実験室酵母からスレオニン蓄積変異体を単離することにより、Hom3に新規なアミノ酸置換Ala462Thrを同定した。このAla462Thr変異型Hom3は、50mM Thrの存在下においてもスレオニンによるフィードバック阻害を受けないことが分かった。Ala462Thrのアミノ酸置換は、Hom3の触媒能には影響を与えなかった。また、酵母にAla462Thr変異型Hom3を発現させると、野生型Hom3を発現する酵母細胞と比較して、細胞内スレオニン含量を大幅に増加させた。
こうして、本発明に係るスレオニンを生産する方法は、以下(a)～(c)のアミノ酸配列を持つAla462Thr置換を有する変異型アスパラギン酸キナーゼHom3を発現させた酵母を用いて、スレオニンを生産する方法、
(a)配列番号１のアミノ酸配列、またはSaccaromyces属に属する酵母のHOM3遺伝子が持つアミノ酸配列のAla462Thr置換を有するアミノ酸配列、
(b)上記(a)のアミノ酸配列に対し、１又は数個のアミノ酸が欠失、置換若しくは付加されたアミノ酸配列であって、Hom3の機能を有するアミノ酸配列、
(c)上記(a)と90%以上（好ましくは95％以上）の配列同一性を備え、かつ上記(a)の452位－461位及び463位－472位のアミノ酸配列が配列番号１と一致し、Hom3の機能を有するアミノ酸配列。
配列番号１は、MPMDFQPTSSHSNWVVQKFGGTSVGKFPVQIVDDIVKHYSKPDGPNNNVAVVCSARSSYTKAEGTTSRLLKCCDLASQESEFQDIIEVIRQDHIDNADRFILNPALQAKLVDDTNKELELVKKYLNASKVLGEVSSRTVDLVMSCGEKLSCLFMTALCNDRGCKAKYVDLSHIVPSDFSASALDNSFYTFLVQALKEKLAPFVSAKERIVPVFTGFFGLVPTGLLNGVGRGYTDLCAALIAVAVNADELQVWKEVDGIFTADPRKVPEARLLDSVTPEEASELTYYGSEVIHPFTMEQVIRAKIPIRIKNVQNPLGNGTIIYPDNVAKKGESTPPHPPENLSSSFYEKRKRGATAITTKNDIFVINIHSNKKTLSHGFLAQIFTILDKYKLVVDLISTSEVHVSMALPIPDADSLKSLRQAEEKLRILGSVDITKKLSIVSLVGKHMKQYI
GIAGTMFTTLTEEGINIEMIS
QGANEINISCVINESDSIKALQCIHAKLLSERTNTSNQFEHAIDERLEQLKRLGIである。
(b）に関して、アミノ酸残基が置換、欠失、挿入および／または付加される数の上限は、Hom3の機能を有する限り、特に限定されない。上限値は、例えば、７個、６個、５個、４個、３個、２個または１個でありうる。
（c)に関して、アミノ酸配列の同一性は、９０％以上、９１％以上、９２％以上、９３％以上、９４％以上、９５％以上、９６％以上、９７％以上、９８％以上、９９％以上、または１００％である。配列同一性は、インターネットを利用したホモロジー検索サイト、例えば日本DNAデータバンク（DDBJ）において、FASTA、BLAST、PSI-BLAST等の相同性検索を利用できる。また、National Center for Biotechnology Information (NCBI) において、BLASTを用いて調べることもできる。
「Hom3の機能を有する」とは、スレオニン生合成の初発反応を触媒すること、すなわちATPを用いてアスパラギン酸のリン酸化を触媒する活性を発揮することを示す。一般に、Saccharomyces属酵母では、Hom3が触媒する反応を経由してスレオニンを生合成することが知られている。そのため、スレオニンを生合成できる酵母ではHom3が機能していると考えられる。
【０００８】
酵母とは、真核で単細胞性の微生物で、運動性はなく、細胞壁を持ち、光合成能はなく、外部の有機物を分解して栄養として吸収する真菌類の総称を意味しており、例えば食品などに用いられてきている出芽酵母の一種であるSaccharomyces属を含む。酵母は、糖をアルコールと炭酸ガスに分解するアルコール発酵を行うことができる。本発明においては、例えばパン酵母、清酒酵母、ワイン酵母、ビール酵母、醤油酵母、バイオエタノール酵母などが含まれる。また、酵母としては、一倍体、二倍体のいずれも用いることができる。
また、別の発明に係る飲食品は、以下(a)～(c)のアミノ酸配列を持つAla462Thr置換を有するアスパラギン酸キナーゼHom3を発現させた酵母を含有する飲食品、
(a)配列番号１のアミノ酸配列、またはSaccaromyces属に属する酵母のHOM3遺伝子にコードされたアミノ酸配列であってAla462Thr置換を有するアミノ酸配列、
(b)上記(a)において、１又は数個のアミノ酸が欠失、置換若しくは付加されたアミノ酸配列であって、Hom3の機能を有するアミノ酸配列、
(c)上記(a)と90％以上（好ましくは95％以上）の配列同一性を備え、かつ上記(a)の452位－461位及び463位－472位のアミノ酸配列が配列番号１と一致し、Hom3の機能を有するアミノ酸配列。
飲食品としては、例えば、飲料（乳含有飲料、コーヒー、紅茶、ジュース、加工乳、スポーツドリンクなど）、ベーカリー（パン、ピザ、パイなど）、洋菓子（クッキー、クラッカー、ビスケット、ケーキ、カステラなど）、麺類、パスタ、スナック菓子、菓子類（キャンディー、キャラメル、ガム、チョコレートなど）、冷菓（アイスクリーム、シャーベットなど）、乳製品（クリーム、チーズ、ムース、粉乳、練乳、乳飲料など）、洋生菓子（ゼリー、プリン、ムース、ヨーグルト、バタークリーム、カスタードクリームなど）、和菓子（求肥、ういろう、もち、おはぎ、どら焼きなど）、果実・野菜の加工食品（ジャム、マーマレード、シロップ漬け、糖果など）、ペースト（フラワーペースト、フルーツペースト、ピーナッツペーストなど）、調味料（醤油、ソース、たれ、麺つゆ、だしの素、スープの素など）、冷凍食品・冷蔵食品（ハム、ソーセージ、ベーコン、ハンバーグ、ミートボール、コロッケ、餃子、ピラフ、おにぎりなど）、水産加工食品（ちくわ、かまぼこなど）などが含まれる。また、飲食品は、ヒト用のみに限られず、ペット（例えばイヌ、ネコなど）用のものも含まれる。飲食品はサプリメント等のヘルスケア製品も含む。
【０００９】
別の発明に係る核酸は、以下(a)～(c)のアミノ酸配列を持つAla462Thr置換を有するアスパラギン酸キナーゼHom3をコードする核酸、
(a)配列番号１のアミノ酸配列、またはSaccaromyces属に属する酵母のHOM3遺伝子にコードされたアミノ酸配列であってAla462Thr置換を有するアミノ酸配列をコードする核酸、
(b)上記(a)において、１又は数個のアミノ酸が欠失、置換若しくは付加されたアミノ酸配列であって、Hom3の機能を有するアミノ酸配列をコードする核酸、
(c)上記(a)と90%以上（好ましくは95％以上）の配列同一性を備え、かつ上記(a)の452位－461位及び463位－472位のアミノ酸配列が配列番号１と一致し、Hom3の機能を有するアミノ酸配列をコードする核酸である。
アミノ酸をコードする遺伝暗号は、トリプレット（3個一組）として64種類があり、アミノ酸は20種類なので、複数のトリプレットが同じアミノ酸に対応している。このため、Ala462Thr置換を有するアスパラギン酸キナーゼHom3を特定する核酸配列は、一種類には限定されない。本発明によれば、Ala462Thr置換を有するアスパラギン酸キナーゼHom3をコードする核酸であれば、スレオニンを高生産する酵母を提供できる。
【００１０】
このとき、核酸の配列が配列番号２（ATGCCAATGGATTTCCAACCTACATCAAGTCATTCGAACTGGGTCGTGCAAAAGTTCGGTGGTACATCTGTCGGTAAATTTCCCGTCCAAATAGTGGATGACATTGTGAAGCACTATTCTAAACCTGACGGCCCAAACAATAATGTCGCTGTCGTTTGTTCCGCCCGTTCTTCATACACCAAGGCTGAAGGTACCACTTCTCGTCTTTTGAAATGTTGTGATTTGGCTTCGCAAGAATCTGAATTTCAAGACATTATCGAAGTTATCAGACAAGACCATATCGATAATGCCGACCGCTTCATTCTCAATCCTGCCTTGCAAGCCAAGTTAGTGGATGATACCAATAAAGAACTTGAACTGGTCAAGAAATATTTAAATGCTTCAAAAGTTTTGGGTGAAGTGAGTTCACGTACAGTAGATCTGGTGATGTCATGTGGTGAGAAGTTGAGTTGTTTGTTCATGACTGCTTTATGTAATGACCGTGGCTGTAAGGCCAAATATGTGGATTTGAGCCACATTGTTCCCTCTGATTTCAGTGCCAGCGCTTTGGATAACAGTTTCTACACTTTCCTGGTTCAAGCATTGAAAGAAAAATTGGCCCCCTTTGTAAGTGCTAAAGAGCGTATCGTTCCAGTCTTTACAGGGTTTTTTGGTTTAGTTCCAACTGGTCTTCTGAATGGTGTTGGTCGTGGCTATACCGATTTATGTGCCGCTTTGATAGCAGTTGCTGTAAATGCTGATGAACTACAAGTTTGGAAGGAAGTTGATGGTATATTTACTGCTGATCCTCGTAAGGTTCCTGAAGCACGTTTGCTAGACAGTGTTACTCCAGAAGAAGCTTCTGAATTAACATATTATGGTTCCGAAGTTATACATCCTTTTACGATGGAACAAGTTATTAGGGCTAAGATTCCTATTAGAATCAAGAATGTTCAAAATCCATTAGGTAACGGTACCATTATCTACCCAGATAATGTAGCAAAGAAGGGTGAATCTACTCCACCACATCCTCCTGAGAACTTATCCTCATCTTTCTATGAAAAGAGAAAGAGAGGTGCCACTGCTATCACCACCAAAAATGACATTTTCGTCATCAACATTCATTCCAATAAGAAAACCCTATCCCATGGTTTCCTAGCTCAAATATTTACCATCCTGGATAAGTACAAGTTAGTCGTAGATTTAATATCTACTTCTGAAGTTCATGTTTCGATGGCTTTGCCCATTCCAGATGCAGACTCATTAAAATCTCTGAGACAAGCTGAGGAAAAATTGAGAATTTTAGGTTCTGTTGATATCACAAAGAAGTTGTCTATTGTTTCATTAGTTGGTAAACATATGAAACAATACATCGGCATTGCTGGTACCATGTTTACTACTCTTACTGAAGAAGGCATCAACATTGAAATGATTTCTCAAGGGGCAAATGAAATAAACATATCCTGCGTTATCAATGAATCTGACTCCATAAAAGCGCTACAATGTATTCATGCCAAGTTACTAAGTGAGCGGACAAATACTTCAAACCAATTTGAACATGCCATTGATGAACGTTTAGAACAATTGAAAAGACTTGGAATTTAA）であることが好ましい。
（【００１１】以降は省略されています）

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