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公開番号2025121937
公報種別公開特許公報(A)
公開日2025-08-20
出願番号2025072068,2023173813
出願日2025-04-24,2017-06-14
発明の名称グルコース依存性ミトコンドリア呼吸及び二相インスリン分泌応答を示すヒト多能性幹細胞由来の機能的ベータ細胞の生成
出願人ヤンセンバイオテツク,インコーポレーテツド
代理人個人,個人,個人,個人,個人
主分類C12N 5/071 20100101AFI20250813BHJP(生化学;ビール;酒精;ぶどう酒;酢;微生物学;酵素学;突然変異または遺伝子工学)
要約【課題】多能性幹細胞の分化から生じる機能的ベータ細胞(機能的膵臓ベータ細胞)及び細胞の集団をインビトロで産生させるための方法を提供する。
【解決手段】膵内胚葉細胞を、PDX1、NKX6.1、MAFA、UCN3、及びSLC2A1を発現する機能的ベータ細胞へと分化させる方法であって、未成熟膵臓ベータ細胞を、a)有効量のT3;ならびにb)有効量の3-デアザネプラノシンA(DEZA)が補充された培地中で培養し、それにより、インスリンを発現する機能的ベータ細胞を産生することを含む、方法である。
【選択図】なし
特許請求の範囲【請求項１】
膵内胚葉細胞を、ＰＤＸ１、ＮＫＸ６．１、ＭＡＦＡ、ＵＣＮ３、及びＳＬＣ２Ａ１を
発現する機能的ベータ細胞へと分化させる方法であって、膵内分泌細胞を、ＵＮＣ０６３
８、ＵＮＣ０６４２、ＵＣＮ０６４６、ＴＣ－Ｅ５００３、Ａ３６６、ＰＦ０３８１４７
３５、ＺＭ４４７４３９、ＳＢ７４７６５１Ａ、ＰＦＩ１、ＬＹ３０３５１１、ＭＳ４３
６、ＡＺＴ、ＤＥＺＡ、ピロキサミド、ＣＩ９９９４、又はＭＣ１５６８のうちの１つ又
は２つ以上が補充された培地中で培養することを含む、方法。
続きを表示（約 780 文字）【請求項２】
前記培養培地に、ヘパリン、Ｎ－アセチルシステイン、製剤Ｉ、及びＴ３、Ｔ４、又は
その類似体のうちの１つ若しくは２つ以上が更に補充される、請求項１に記載の方法。
【請求項３】
前記培養培地がＡＬＫ５阻害剤を欠く、請求項１又は２に記載の方法。
【請求項４】
前記培養培地にＡＬＫ５阻害剤が補充される、請求項１又は２に記載の方法。
【請求項５】
前記培地に、ＺＭ４４７４３９、ヘパリン、Ｎ－アセチルシステイン、及びＴ３、Ｔ４
、又はその類似体のうちの１つ又は２つ以上が補充され、前記培地がＡＬＫ５阻害剤を含
有しない、請求項１に記載の方法。
【請求項６】
前記培地にＴ３が補充される、請求項５に記載の方法。
【請求項７】
前記培地にＡＺＴが補充される、請求項６に記載の方法。
【請求項８】
前記培地にＤＥＺＡが補充される、請求項７に記載の方法。
【請求項９】
前記機能的ベータ細胞が、胚体内胚葉に特徴的なマーカーを発現する細胞、初期腸管細
胞に特徴的なマーカーを発現する細胞、前腸内胚葉細胞に特徴的なマーカーを発現する細
胞、膵内胚葉細胞に特徴的なマーカーを発現する細胞、膵内分泌前駆細胞に特徴的なマー
カーを発現する細胞、未成熟ベータ細胞に特徴的なマーカーを発現する細胞、及び機能的
ベータ細胞に特徴的なマーカーを発現する細胞のうちの１つ又は２つ以上の段階的分化に
よって得られる、請求項１に記載の方法。
【請求項１０】
前記方法が、空気－液体界面で前記細胞を培養することを含む、請求項１に記載の方法
。
（【請求項１１】以降は省略されています）
発明の詳細な説明【技術分野】
【０００１】
（関連出願の相互参照）
本出願は、米国特許仮出願第６２／３５２，９６８号（２０１６年６月２１日出願）に
対する優先権を主張し、その全体が参照により組み込まれる。
続きを表示（約 2,700 文字）【０００２】
（発明の分野）
本発明は、多能性幹細胞の分化から生じる機能的膵臓ベータ細胞及び集団をインビトロ
で産生するための方法に関する。特に、本発明は、ミトコンドリア呼吸／活性応答及び二
相インスリン分泌応答を呈するベータ細胞又はベータ細胞の集団に関する。
【背景技術】
【０００３】
Ｉ型真性糖尿病の細胞補充療法の進歩及び移植可能なランゲルハンス島の不足により、
生着に適したインスリン産生細胞、又はベータ（β）細胞の供給源の開発に注目が集まっ
ている。１つの手法として、胚性幹細胞又は誘導性多能性幹細胞などの多能性幹細胞から
機能的ベータ細胞を生成するものがある。
【０００４】
脊椎動物の胚発生では、多能性細胞は、原腸形成として知られるプロセスにおいて３つ
の胚葉（外胚葉、中胚葉、及び内胚葉）から構成される細胞群を生じる。例えば、甲状腺
、胸腺、膵臓、腸、及び肝臓などの組織は、内胚葉から中間ステージを経て発達する。
【０００５】
Ｄ’Ａｍｏｕｒらは、高濃度のアクチビン及び低血清の存在下でのヒト胚性幹細胞由来
の胚体内胚葉の濃縮培地の産生を記載した（ＮａｔｕｒｅＢｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ
２００５，２３：１５３４～１５４１；米国特許第７，７０４，７３８号）。マウスの
腎臓被膜下でのこれらの細胞の移植により、内胚葉組織の特徴を有する、より成熟した細
胞への分化が生じた（米国特許第７，７０４，７３８号）。ヒト胚性幹細胞由来の胚体内
胚葉細胞は、ＦＧＦ－１０及びレチノイン酸の添加後、ＰＤＸ１陽性細胞に更に分化させ
ることができる（米国特許出願公開第２００５／０２６６５５４号）。免疫不全マウスの
脂肪パッド中のこれら膵臓前駆細胞のその後の移植により、３～４ヶ月の成熟期の後に、
機能的膵内分泌細胞の形成が生じた（米国特許第７，５３４，６０８号及び同第７，９９
３，９２０号）。
【０００６】
小分子阻害剤が、膵内分泌前駆細胞の誘導のために使用されている。例えば、ＴＧＦ－
β受容体及びＢＭＰ受容体の小分子阻害剤（Ｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔ２０１１，１３８
：８６１～８７１；Ｄｉａｂｅｔｅｓ２０１１，６０：２３９～２４７）は、膵内分泌
細胞の数を増強するために使用されている。加えて、小分子活性因子もまた、胚体内胚葉
細胞又は膵内胚葉細胞を生成するために使用されている（Ｃｕｒｒ．Ｏｐｉｎ．Ｃｅｌｌ
Ｂｉｏｌ．，２００９，２１：７２７～７３２）。ＮａｔｕｒｅＣｈｅｍ．Ｂｉｏｌ
．，２００９，５：２５８～２６５）。
【０００７】
一般に、前駆細胞を機能的ベータ細胞に分化させるプロセスは、様々なステージを経て
進み、ヒト多能性幹細胞などの前駆細胞から膵臓細胞を生成するためのプロトコルを改善
することにおいて進歩した。研究におけるこれらの進歩にも関わらず、前駆細胞を分化さ
せるプロセスの各工程は、特有の問題を提示する。このため、機能的膵内分泌細胞、とり
わけ機能的ベータ細胞を産生する目的で、更なる分化プロトコル開発の必要性が依然とし
て存在する。特に、機能性ベータ細胞で観察される急速かつ調節されたグルコース刺激性
インスリン分泌（「ＧＳＩＳ」）を可能にするグルコース応答性インスリン産生細胞のイ
ンビトロの生成を提供することが望ましい。具体的には、第１相及び第２相のインスリン
分泌後にミトコンドリア呼吸／活性の増加を呈する機能的ベータ細胞をインビトロで産生
する方法を提供することが望ましい。
【０００８】
ＧＳＩＳは、グルコース輸送体（溶質担体ファミリー２、メンバー１；ＳＬＣ２Ａ１；
又はグルコース輸送体１と一般に称される；ヒトベータ細胞のＧＬＵＴ１）、及びグルコ
ースのピルビン酸塩への代謝を介して、解糖という名のプロセスをとおして、グルコース
をベータ細胞中に取り込むことによって開始される。ミトコンドリアへのピルビン酸塩の
取り込み、ＴＣＡ（トリカルボン酸、及び後続の電子伝達鎖（「ＥＴＣ」、本明細書では
「ミトコンドリア活性」又は「ミトコンドリア呼吸」と称される）の活性化）サイクルを
とおしたその代謝は、インスリンエキソサイトーシスと密接に連結することで、急速かつ
正しい量のインスリン放出を確実にする。
【０００９】
膵島内の機能的ベータ細胞は、２つの連続相においてグルコース濃度の急激な増加の際
にインスリンを分泌することが示されている（Ｈｅｎｑｕｉｎｅｔａｌ．Ｄｉａｂｅ
ｔｏｌｏｇｉａ（２００９）５２（５）：７３９～７５１）。両方の相の振幅及び持続期
間は、細胞内Ｃａ
２＋
シグナル又は相加分泌結合因子の動態によって調節される。第１の
相（１
ｓｔ
）のインスリン分泌は、結合し、容易に解放可能なインスリン顆粒の小さいプ
ールのエキソサイトーシスを表す。振幅はより小さいが持続期間がより長い第２の相（２
ｎｄ
）のインスリン分泌は、顆粒を顆粒の貯蔵プールから移動させること、及び解放のた
めにそれらをドッキング／プライミングすることを表す。ベータ細胞における成熟の重要
なマーカーである二相性ＧＳＩＳは、ヒト発達の出生後の相まで検出されず、未成熟ベー
タ細胞に見られる単相性ＧＳＩＳとは対照的である（Ｏｔｏｎｋｏｓｋｉｅｔａｌ．
Ｄｉａｂｅｔｅｓ（１９８８）３７：２８６～２９１）。
【００１０】
２型糖尿病では、ＧＳＩＳの第１の相は存在せず、ＧＳＩＳの第２の相も低下する。ベ
ータ細胞数が自己免疫攻撃により大きく低下する１型糖尿病は、確固とした二相性ＧＳＩ
Ｓを欠くことが報告されている（Ｋｒｏｇｖｏｌｄｅｔａｌ．Ｄｉａｂｅｔｅｓ（２
０１５）６４：２５０６～２５１２）。
【発明の概要】
【課題を解決するための手段】
（【００１１】以降は省略されています）

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