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公開番号2025126268
公報種別公開特許公報(A)
公開日2025-08-28
出願番号2025105913,2023068770
出願日2025-06-23,2020-12-11
発明の名称非天然アミノ酸を含むペプチドの製造方法
出願人中外製薬株式会社
代理人個人,個人,個人
主分類C12P 21/02 20060101AFI20250821BHJP(生化学;ビール;酒精;ぶどう酒;酢;微生物学;酵素学;突然変異または遺伝子工学)
要約【課題】非天然アミノ酸を含むペプチドの効率的な製造方法、並びに当該方法において使用するための改変されたL31タンパク質、およびこれを含むリボソームを提供すること。
【解決手段】ペプチドの製造方法であって、改変されたL31タンパク質を含むリボソームを含む翻訳系中で、1種または複数種の非天然アミノ酸を含むペプチドをコードするmRNAを翻訳する工程を含み、前記改変されたL31タンパク質を含むリボソームは、配列番号:1のアミノ酸配列を含む大腸菌野生型L31を含むリボソームと比較して、前記非天然アミノ酸を含むペプチドの翻訳活性が大きい、前記方法。
【選択図】なし

特許請求の範囲【請求項１】
明細書に記載の発明。

発明の詳細な説明【技術分野】
【０００１】
本発明は、非天然アミノ酸を含むペプチドまたは当該ペプチドを含むライブラリの製造方法に関する。また本発明は、当該方法において使用するための改変されたＬ３１タンパク質等に関する。
続きを表示（約 6,700 文字）【背景技術】
【０００２】
近年、非天然アミノ酸を複数含む多様なペプチドのライブラリから医薬品の候補物質を選択する創薬方法が考えられている。なかでも無細胞翻訳系を利用した非天然アミノ酸を含有するペプチドのｍＲＮＡディスプレイライブラリなどは、その多様性、スクリーニングの簡便性の点から期待が集まっている。翻訳系を利用した非天然アミノ酸を含むペプチドの合成法はいくつか報告されている（非特許文献１、２）。しかしながら、これらの文献に記載された方法では翻訳合成の効率が低い。
【０００３】
生体内では、ペプチドは、ｍＲＮＡが有する塩基配列情報に即してアミノ酸が重合されることによって合成される。このペプチドの合成過程は翻訳と呼ばれる。翻訳の過程で中心的な役割を果たすのがリボソームである。ｍＲＮＡディスプレイライブラリの調製に用いられる無細胞翻訳系には、通常、精製したリボソームが添加されている。
【０００４】
リボソームを構成するタンパク質として、Ｌ３１タンパク質が知られている。Ｌ３１タンパク質はinter subunit Bridge B1bを形成しているタンパク質で、３０Ｓと５０Ｓとの会合状態（７０Ｓ）を安定化する役割がある（非特許文献３）。
【０００５】
Ｌ３１タンパク質は、その精製中にプロテアーゼ７によって分解を受けることが知られている。大腸菌野生型株から調製されたリボソーム、プロテアーゼ７を欠損したprotease7 KO株から調製されたリボソーム、およびＬ３１タンパク質を欠損したL31KO株から調製したリボソームについてこれらの活性を比較すると、プロテアーゼ７欠損株から調製したリボソームは、大腸菌野生型株から調製したリボソームやＬ３１欠損株から調製したリボソームと比較して、その活性が大きいことが報告されている（非特許文献３）。またＬ３１欠損株から調製されたリボソームは、in vivoにおいてinitiation rateが３８％下がること、in vitroにおいて７０Ｓの形成速度が遅くなることも報告されている（非特許文献４）。さらに、Ｌ３１欠損株ではFidelityが下がることも報告されている（非特許文献４）。このように、天然アミノ酸からなるペプチドの翻訳においては、プロテアーゼ７による分解を受けていないＬ３１タンパク質を含むリボソームは、切断されたＬ３１タンパク質を含むリボソームやＬ３１タンパク質を含まないリボソームよりもその活性が大きいことが知られていた。
【先行技術文献】
【非特許文献】
【０００６】
Maini, R., Umemoto, S. &Suga, H. Ribosome-mediated synthesis ofnatural product-like peptides viacell-free translation. Current opinion inchemical biology 34, 44-52,doi:10.1016/j.cbpa.2016.06.006 (2016).
Hartman, M. C., Josephson, K.,Lin, C. W. & Szostak, J. W. Anexpanded set of amino acid analogs for theribosomal translation of unnaturalpeptides. PloS one 2, e972,doi:10.1371/journal.pone.0000972 (2007).
Ueta M, Wada C, Bessho Y, MaedaM, Wada A. Genes Cells. 2017May;22(5):452-471. doi: 10.1111/gtc.12488. Epub2017 Apr 10. Genes Cells. 2017
Lilleorg S, Reier K, Remme J,Liiv A. J Mol Biol. 2017 Apr7;429(7):1067-1080. doi: 10.1016/j.jmb.2017.02.015.Epub 2017 Feb 24. J Mol Biol.2017
Chadani Y, Niwa T, Izumi T,Sugata N, Nagao A, Suzuki T, Chiba S, ItoK, Taguchi H. Mol Cell. 2017 Nov2;68(3):528-539.e5. doi:10.1016/j.molcel.2017.10.020. Mol Cell. 2017
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００７】
本発明は、一局面において、非天然アミノ酸を含むペプチドの効率的な製造方法、並びに当該方法において使用するための改変されたＬ３１タンパク質、およびこれを含むリボソームを提供することを課題とする。
【課題を解決するための手段】
【０００８】
本発明者らは、翻訳系を利用して非天然アミノ酸を含むペプチドを製造するにあたり、プロテアーゼ７による分解を受けていないＬ３１タンパク質を含むリボソームとプロテアーゼ７により切断されたＬ３１タンパク質を含むリボソームとの間で、ｍＲＮＡの翻訳効率に違いが生じるか検討を試みた。その結果本発明者らは、イニシエーションサプレッション（Initiation Suppression:iSP）法により非天然アミノ酸を含むペプチドをコードするｍＲＮＡを翻訳するときに、プロテアーゼ７により切断されたＬ３１タンパク質を含むリボソームを使用すると、プロテアーゼ７による分解を受けていないＬ３１タンパク質を含むリボソームを使用する場合と比較して、目的産物の翻訳量が増加することを見出した。また本発明者らは、プロテアーゼ７により切断されたＬ３１タンパク質を含むリボソームを使用することにより、副生成物の相対的な量も減少させることが可能なことを見出した。これらの結果は、非天然アミノ酸を含まないペプチドの翻訳において従来知られていた事実とは逆の結果であった。さらに本発明者らは、翻訳系のマグネシウムイオン濃度を変えてペプチドの合成を行ったところ、マグネシウムイオン濃度が一定の濃度範囲にある場合に翻訳量が多く、かつ副生成物の割合も低いことを明らかにした。
【０００９】
本発明はこのような知見に基づくものであり、具体的には以下〔１〕～〔３７〕に関する。
〔１〕ペプチドの製造方法であって、改変されたＬ３１タンパク質を含むリボソームを含む翻訳系中で、１種または複数種の非天然アミノ酸を含むペプチドをコードするｍＲＮＡを翻訳する工程を含み、前記改変されたL３１タンパク質を含むリボソームは、配列番号：１のアミノ酸配列を含む大腸菌野生型Ｌ３１を含むリボソームと比較して、前記非天然アミノ酸を含むペプチドの翻訳活性が大きい、前記方法。
〔２〕ペプチドの製造方法であって、改変されたＬ３１タンパク質を含むリボソームを含む翻訳系中で、１種または複数種の非天然アミノ酸を含むペプチドをコードするｍＲＮＡを翻訳する工程を含み、前記改変されたＬ３１タンパク質が、以下の（１）から（３）に記載のタンパク質からなる群より選択される、前記方法：
（１）配列番号：１で表されるアミノ酸配列において、C末端から6以上のアミノ酸残基が欠失したアミノ酸配列を含むタンパク質、
（２）前記（１）に記載のタンパク質のアミノ酸配列において、１または複数のアミノ酸が挿入、置換、欠失および／または付加されたアミノ酸配列を含むタンパク質、
（３）前記（１）に記載のタンパク質のアミノ酸配列と８０％以上の配列同一性を有するアミノ酸配列を含むタンパク質。
〔３〕ペプチドの製造方法であって、改変されたＬ３１タンパク質を含むリボソームを含む翻訳系中で、１種または複数種の非天然アミノ酸を含むペプチドをコードするｍＲＮＡを翻訳する工程を含み、前記改変されたＬ３１タンパク質が、以下の（１）から（３）に記載のタンパク質からなる群より選択される、前記方法：
（１）配列番号：１で表されるアミノ酸配列において、C末端から6以上のアミノ酸残基が欠失したアミノ酸配列からなるタンパク質、
（２）前記（１）に記載のタンパク質のアミノ酸配列において、１または複数のアミノ酸が挿入、置換、欠失および／または付加されたアミノ酸配列からなるタンパク質、
（３）前記（１）に記載のタンパク質のアミノ酸配列と８０％以上の配列同一性を有するアミノ酸配列からなるタンパク質。
〔４〕前記（１）に記載の、C末端から6以上のアミノ酸残基が欠失したアミノ酸配列が、C末端から8以上のアミノ酸残基が欠失したアミノ酸配列である、〔２〕または〔３〕に記載の方法。
〔５〕前記（１）に記載の、配列番号：１で表されるアミノ酸配列において、C末端から8以上のアミノ酸残基が欠失したアミノ酸配列が、配列番号：２および４２～４８からなる群より選択されるアミノ酸配列である、〔４〕に記載の方法。
〔６〕前記（２）および前記（３）に記載のタンパク質を含むリボソームが、配列番号：１のアミノ酸配列を含む大腸菌野生型Ｌ３１を含むリボソームと比較して、非天然アミノ酸を含むペプチドの翻訳活性が大きい、〔２〕～〔５〕のいずれかに記載の方法。
〔７〕前記（１）に記載のタンパク質を含むリボソームが、配列番号：１のアミノ酸配列を含む大腸菌野生型Ｌ３１を含むリボソームと比較して、非天然アミノ酸を含むペプチドの翻訳活性が大きい、〔２〕～〔６〕のいずれかに記載の方法。
〔８〕前記C末端から6以上のアミノ酸残基が欠失したアミノ酸配列が、C末端から6～50個のアミノ酸残基が欠失したアミノ酸配列である、〔２〕～〔７〕のいずれかに記載の方法。
〔９〕前記C末端から6以上のアミノ酸残基が欠失したアミノ酸配列が、C末端から8～50個のアミノ酸残基が欠失したアミノ酸配列である、〔２〕～〔７〕のいずれかに記載の方法。
〔１０〕前記C末端から6以上のアミノ酸残基が欠失したアミノ酸配列が、C末端から6～43個のアミノ酸残基が欠失したアミノ酸配列である、〔２〕～〔７〕のいずれかに記載の方法。
〔１１〕前記C末端から6以上のアミノ酸残基が欠失したアミノ酸配列が、C末端から8～43個のアミノ酸残基が欠失したアミノ酸配列である、〔２〕～〔７〕のいずれかに記載の方法。
〔１２〕前記改変されたＬ３１タンパク質が、配列番号：１で表されるアミノ酸配列において、C末端から8以上のアミノ酸残基が欠失したアミノ酸配列からなるタンパク質である、〔１〕～〔１１〕のいずれかに記載の方法。
〔１３〕前記改変されたＬ３１タンパク質が、配列番号：２および４２～４８からなる群より選択されるいずれかで表されるアミノ酸配列からなるタンパク質である、〔１〕～〔１２〕のいずれかに記載の方法。
〔１４〕前記翻訳系における、全リボソームに対する前記改変されたＬ３１タンパク質を含むリボソームの割合が５０％以上である、〔１〕～〔１３〕のいずれかに記載の方法。
〔１５〕前記翻訳系が２～８ｍＭのマグネシウムイオンをさらに含む、〔１〕～〔１４〕のいずれかに記載の方法。
〔１６〕前記ペプチドを環化する工程をさらに含む、〔１〕～〔１５〕のいずれかに記載の方法。
〔１７〕前記ペプチドが、その開始アミノ酸の位置に非天然アミノ酸を含む、〔１〕～〔１６〕のいずれかに記載の方法。
〔１８〕前記翻訳が、イニシエーションサプレッションにより行われる、〔１〕～〔１７〕のいずれかに記載の方法。
〔１９〕前記翻訳系に含まれる開始tRNAに非天然アミノ酸がアシル化されている、〔１〕～〔１８〕のいずれかに記載の方法。
〔２０〕前記翻訳活性が、全翻訳産物に対するアミノ酸の読み飛ばしが生じている翻訳産物の割合（iRT割合）で評価される、〔１〕～〔１９〕のいずれかに記載の方法。
〔２１〕前記翻訳活性が、配列番号：１０の鋳型mRNAを用いて、配列番号：２９のペプチドを翻訳することにより評価される、〔１〕～〔２０〕のいずれかに記載の方法。
〔２２〕配列番号：１のアミノ酸配列を含む大腸菌野生型Ｌ３１を含むリボソームのiRT割合と比較して、前記改変されたＬ３１タンパク質を含むリボソームのiRT割合が15%以上低い、〔１〕～〔２１〕のいずれかに記載の方法。
〔２３〕〔１〕～〔２２〕のいずれかに記載の方法により製造されたペプチドまたは当該ペプチドを含む、ライブラリ。
〔２４〕以下（ａ）および（ｂ）に記載の工程を含む、標的物質に結合するペプチドのスクリーニング方法；
（ａ）〔１〕～〔２２〕のいずれかに記載された方法によって得られるペプチドまたは当該ペプチドを含むライブラリ、もしくは、〔２３〕に記載されたペプチドまたはライブラリに標的物質を接触させる工程、および
（ｂ）前記標的物質に結合するペプチドを選択する工程。
〔２５〕〔２〕～〔２４〕のいずれかに記載の、改変されたL31タンパク質。
〔２６〕〔２５〕に記載の、改変されたL31タンパク質（ただし、配列番号：２で表されるアミノ酸配列からなるL31タンパク質を除く）。
〔２７〕〔２５〕または〔２６〕に記載の改変されたＬ３１タンパク質をコードする単離された核酸。
〔２８〕〔２７〕に記載の核酸を含むベクターまたは細胞。
〔２９〕以下（ａ）～（ｃ）に記載の工程を含む、改変されたＬ３１タンパク質を含むリボソームの製造方法；
（ａ）〔２８〕に記載の細胞を培養する工程、
（ｂ）前記細胞の培養物から溶解液を生成する工程、および
（ｃ）前記溶解液からリボソームを精製する工程。
〔３０〕以下（ａ）および（ｂ）に記載の工程を含む、改変されたＬ３１タンパク質の製造方法；
（ａ）〔２８〕に記載の細胞を培養する工程、および
（ｂ）前記細胞の培養物から発現産物を単離する工程。
〔３１〕以下（ａ）および（ｂ）に記載の工程を含む、リボソームの製造方法；
（ａ）マグネシウムイオン濃度が５ｍＭ以下の条件下において、フレンチプレスを使用して、野生型大腸菌の培養物から溶解液を生成する工程、および、
（ｂ）前記溶解液からリボソームを精製する工程。
〔３２〕〔２５〕または〔２６〕に記載の改変されたL31タンパク質を含むリボソーム。
〔３３〕〔３２〕に記載のリボソームを含む組成物。
〔３４〕〔３３〕に記載の組成物であって、全リボソームに対する前記改変されたＬ３１タンパク質を含むリボソームの割合が５０％以上である、組成物。
【発明の効果】
【００１０】
本発明により、非天然アミノ酸を含むペプチドおよび当該ペプチドを含むライブラリの効率的な製造方法が提供された。また本発明により、当該方法において使用するための改変されたＬ３１タンパク質、およびこれを含むリボソームが提供された。本発明の方法を用いることにより、非天然アミノ酸を含むペプチドやそのライブラリを効率的に製造することができる。
従来、プロテアーゼ７により切断されたＬ３１タンパク質を含むリボソームは、切断されていないＬ３１タンパク質を含むリボソームよりもその活性が劣ることが示唆されていた。この事実を踏まえると、本明細書における改変されたＬ３１タンパク質を含むリボソームを用いることによって非天然アミノ酸を含むペプチドを効率的に翻訳できることは驚くべき効果であった。
【図面の簡単な説明】
（【００１１】以降は省略されています）

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