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公開番号2025114603
公報種別公開特許公報(A)
公開日2025-08-05
出願番号2025068537,2023067539
出願日2025-04-18,2018-11-28
発明の名称リガンド結合活性が調整可能なリガンド結合分子
出願人中外製薬株式会社
代理人個人,個人,個人,個人,個人,個人,個人,個人,個人,個人,個人,個人,個人,個人
主分類C07K 16/24 20060101AFI20250729BHJP(有機化学)
要約【課題】切断サイトが切断されることでリガンドへの結合活性が減弱するリガンド結合分子及びその製造方法、複合体、融合タンパク質、並びに医薬組成物を提供する。
【解決手段】抗体VHと抗体VLとを含むリガンド結合分子であって、リガンド結合分子はリガンドに結合可能であり、プロテアーゼ切断配列を少なくとも一つ含み、リガンド結合分子中の抗体VLと抗体VHは会合しており、会合はプロテアーゼ切断配列がプロテアーゼで切断されることにより解消され、プロテアーゼ切断配列が切断された状態におけるリガンド結合分子のリガンドに対する結合が、プロテアーゼ切断配列が未切断の状態におけるリガンド結合分子のリガンドに対する結合より弱い、リガンド結合分子を提供する。
【選択図】図2
特許請求の範囲【請求項１】
抗体VHと抗体VLとを含むリガンド結合分子であって、当該リガンド結合分子はリガンドに結合可能であり、当該分子は配列番号：３３５－３４５、５３８－１１４５、１１８３－１２８１、１３８２－１３８５で示す配列から選ばれる一つまたは複数の配列を含むプロテアーゼ切断配列を少なくとも一つ含み、前記リガンド結合分子中の前記抗体VLと前記抗体VHは会合しており、当該会合は前記プロテアーゼ切断配列がプロテアーゼで切断されることにより解消され、前記プロテアーゼ切断配列が切断された状態における当該リガンド結合分子のリガンドに対する結合が、前記プロテアーゼ切断配列が未切断の状態における当該リガンド結合分子のリガンドに対する結合より弱い、リガンド結合分子。
続きを表示（約 810 文字）【請求項２】
前記プロテアーゼ切断配列が切断された状態では、前記リガンドが前記リガンド結合分子から遊離する、請求項１に記載のリガンド結合分子。
【請求項３】
前記プロテアーゼ切断配列は、癌組織特異的プロテアーゼまたは炎症組織特異的プロテアーゼにより切断される、請求項１または請求項２に記載のリガンド結合分子。
【請求項４】
前記リガンド結合分子は、抗体定常領域をさらに含む、請求項１から請求項３のいずれか一項に記載のリガンド結合分子。
【請求項５】
前記プロテアーゼ切断配列は、前記抗体定常領域と前記抗体VHの境界付近、および／または前記抗体定常領域と前記抗体VLとの境界付近に位置する、請求項４に記載のリガンド結合分子。
【請求項６】
前記リガンドは生物活性を有する分子であり、前記リガンド結合分子は前記リガンドとの結合で前記リガンドの生物活性を阻害する、請求項１から請求項５のいずれか一項に記載のリガンド結合分子。
【請求項７】
前記リガンドはサイトカインまたはケモカインである、請求項１から請求項６のいずれか一項に記載のリガンド結合分子。
【請求項８】
前記リガンド結合分子はIgG抗体である、請求項１から請求項７のいずれか一項に記載のリガンド結合分子。
【請求項９】
前記リガンドと、請求項１から請求項７のいずれか一項に記載のリガンド結合分子とで形成されている複合体であって、前記リガンドが前記リガンド結合分子に結合している、複合体。
【請求項１０】
前記リガンドと、請求項１から請求項７のいずれか一項に記載のリガンド結合分子とで形成されている融合タンパク質であって、前記リガンドが前記リガンド結合分子と融合されている融合タンパク質。
（【請求項１１】以降は省略されています）
発明の詳細な説明【技術分野】
【０００１】
本発明は、少なくとも一つの切断サイトを有し、当該切断サイトが切断された状態でリガンドとの結合が減弱されるリガンド結合分子、当該リガンド結合分子の製造方法、ならびに当該リガンド結合分子を含む医薬組成物を提供する。
続きを表示（約 9,400 文字）【背景技術】
【０００２】
抗体は血漿中での安定性が高く、副作用も少ないことから医薬品として注目されている。中でもIgG型の抗体医薬は多数上市されており、現在も数多くの抗体医薬が開発されている（非特許文献１、および非特許文献２）。
【０００３】
抗体医薬を用いた癌治療薬として、これまでのCD20抗原に対するリツキサン、EGFR抗原に対するセツキシマブ、HER2抗原に対するハーセプチン等が承認されている（非特許文献３）。これらの抗体分子は、癌細胞に発現している抗原に対して結合し、ADCCやシグナル阻害等によって癌細胞に対する傷害活性を発揮する。
【０００４】
また、癌細胞に高発現する癌抗原に結合する抗体分子にサイトカインなどの生理活性を有するリガンドを融合させたイムノサイトカインによって、リガンドを固形癌にデリバリーする方法が知られている。イムノサイトカインによって固形癌にデリバリーされたサイトカインが免疫を活性化させることで抗腫瘍効果を発揮する。IL-2、IL-12やTNFをはじめとするサイトカインは毒性が強いため、これらのサイトカインを癌局所で働かせるために抗体によって癌局所にデリバリーすることで副作用を軽減しつつ、効果を強めることが期待されているが（非特許文献４、５、６）、これらはいずれも全身投与では臨床で十分な効果を示さない、therapeutic windowが狭い、毒性が強く全身投与ができない、などの課題があり、未だに医薬品として承認されていない。
【０００５】
この大きな原因として、イムノサイトカインであっても全身投与したサイトカインは全身に暴露されてしまうため、全身で作用して毒性を発揮しうる、あるいは毒性を回避するために極めて低い用量でしか投与できないことが挙げられる。癌抗原に結合する抗体にIL-2を融合したイムノサイトカインと癌抗原に結合しない抗体にIL-2を融合したイムノサイトカインで抗腫瘍効果は変わらなかったという報告もある（非特許文献７）。
【０００６】
上記の問題を回避する方法として、サイトカインとサイトカインレセプターの間を癌で高発現するプロテアーゼによって切断されるリンカーで結合させた分子が報告されている。サイトカインはリンカーで結合されたサイトカインレセプターによって阻害されているが、リンカーがプロテアーゼによって切断されるとサイトカインがサイトカインレセプターから遊離し、活性体になる。例としてTNF-alphaとTNF-RをuPAで切断されるリンカーで結合させた分子（非特許文献８）が報告され、IL-2とIL-2RをMMP-2で切断されるリンカーで結合させた分子（非特許文献９）が報告されている。しかしながら、これらの分子はリンカーの切断前であってもサイトカインは活性を有しており、リンカーの切断によって活性が約10倍程度しか向上しない。また、IL-2Rに代わり抗IL-2 scFvをMMP-2で切断されるリンカーを介してIL-2と結合させた分子（非特許文献９）が報告されている。
【先行技術文献】
【非特許文献】
【０００７】
Monoclonal antibody successes in the clinic. Janice M Reichert, Clark J Rosensweig, Laura B Faden & Matthew C Dewitz, Nat. Biotechnol. (2005) 23, 1073-1078
The therapeutic antibodies market to 2008. Pavlou AK, Belsey MJ., Eur. J. Pharm. Biopharm. (2005) 59 (3), 389-396
Monoclonal antibodies: versatile platforms for cancer immunotherapy. Weiner LM, Surana R, Wang S., Nat. Rev. Immunol. (2010) 10 (5), 317-327
Cyclophosphamide and tucotuzumab (huKS-IL2) following first-line chemotherapy in responding patients with extensive-disease small-cell lung cancer. Gladkov O, Ramlau R, Serwatowski P, Milanowski J, Tomeczko J, Komarnitsky PB, Kramer D, Krzakowski MJ. Anticancer Drugs. 2015 Nov;26(10):1061-8.
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Isolated limb perfusion with the tumor-targeting human monoclonal antibody-cytokine fusion protein L19-TNF plus melphalan and mild hyperthermia in patients with locally advanced extremity melanoma. Papadia F, Basso V, Patuzzo R, Maurichi A, Di Florio A, Zardi L, Ventura E, Gonzalez-Iglesias R, Lovato V, Giovannoni L, Tasciotti A, Neri D, Santinami M, Menssen HD, De Cian F. J Surg Oncol. 2013 Feb;107(2):173-9.
Antigen specificity can be irrelevant to immunocytokine efficacy and biodistribution. Tzeng A, Kwan BH, Opel CF, Navaratna T, Wittrup KD. Proc Natl Acad Sci U S A. 2015 Mar 17;112(11):3320-5.
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Immunology. 2011 Jun;133(2):206-20. doi: 10.1111/j.1365-2567.2011.03428.x. Epub 2011 Mar 23. Development of an attenuated interleukin-2 fusion protein that can be activated by tumour-expressed proteases. Puskas J1, Skrombolas D, Sedlacek A, Lord E, Sullivan M, Frelinger J.
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００８】
本発明は、このような情況に鑑みて為されたものであり、その目的の一つは、サイトカインあるいはケモカイン等のリガンドを標的組織において選択的に活性化するリガンド結合分子、当該リガンド結合分子を含む医薬組成物、当該医薬組成物および当該有効成分の製造方法を提供することにある。
【課題を解決するための手段】
【０００９】
本発明者らは、上記の目的を達成するために鋭意研究を進めたところ、切断サイトが切断されることでリガンドへの結合活性が減弱するリガンド結合分子を創作した。また、本発明者らは、当該リガンド結合分子または当該リガンド結合分子を含む医薬組成物が、当該リガンドを用いて疾患を治療することに有用であることを見出すとともに、当該リガンド結合分子を投与することを含む疾患の治療に有用であること、及び疾患の治療のための医薬の製造において当該リガンド結合分子が有用であることを見出した。また、本発明者らは、当該リガンド結合分子の製造方法を創作して本発明を完成させた。
【００１０】
本発明はこのような知見に基づくものであり、具体的には以下に例示的に記載する態様を包含するものである。
（１）リガンドに結合可能な分子であって、当該分子は切断サイトを少なくとも一つ有するポリペプチドであり、且つ当該分子が少なくとも一つの切断サイトで切断された状態でリガンドとの結合が減弱される、リガンド結合分子。
（２）前記切断サイトが切断された状態では、前記リガンドが前記リガンド結合分子から遊離する、（１）に記載のリガンド結合分子。
（３）前記切断サイトはプロテアーゼ切断配列を含む、（１）または（２）に記載のリガンド結合分子。
（４）前記プロテアーゼは標的組織特異的プロテアーゼである、（３）に記載のリガンド結合分子。
（５）前記標的組織が癌組織であり、前記標的組織特異的プロテアーゼは癌組織特異的プロテアーゼである、（４）記載のリガンド結合分子。
（６）前記標的組織が炎症組織であり、前記標的組織特異的プロテアーゼは炎症組織特異的プロテアーゼである、（４）記載のリガンド結合分子。
（７）前記プロテアーゼは、マトリプターゼ、ウロキナーゼ（ｕＰＡ）、およびメタロプロテアーゼから選択される少なくとも一つのプロテアーゼである、（３）から（６）のいずれかに記載のリガンド結合分子。
（８）前記プロテアーゼ切断配列は、配列番号：３、３４、６６、７０、７１、７２、７３、３５、７５、７６、３３５～３４５、１１６１～１１８０、１３９２～１４１１で示す配列、表１に記載の配列から選ばれる配列を含む配列である、（３）に記載のリガンド結合分子。
（９）前記プロテアーゼ切断配列の一端に、第一可動リンカーが更に付加されている、（３）から（８）のいずれかに記載のリガンド結合分子。
（１０）前記プロテアーゼ切断配列の他端に、第二可動リンカーが更に付加されている、（９）に記載のリガンド結合分子。
（１１）前記第一可動リンカーは、グリシン-セリンポリマーからなる可動リンカーである、（９）に記載のリガンド結合分子。
（１２）前記第二可動リンカーは、グリシン-セリンポリマーからなる可動リンカーである、（１０）に記載のリガンド結合分子。
（１３）前記リガンド結合分子は抗体VHと、抗体VLと、抗体定常領域を含む、（１）から（１２）のいずれかに記載のリガンド結合分子。
（１４）前記切断サイト、または前記プロテアーゼ切断配列、またはプロテアーゼ切断配列と第一可動リンカー、またはプロテアーゼ切断配列と第一可動リンカーと第二可動リンカーは、前記抗体定常領域内に位置する、（１３）に記載のリガンド結合分子。
（１５）前記切断サイト、または前記プロテアーゼ切断配列、またはプロテアーゼ切断配列と第一可動リンカー、またはプロテアーゼ切断配列と第一可動リンカーと第二可動リンカーは、抗体重鎖定常領域１１８番アミノ酸（EUナンバリング）から抗体重鎖定常領域１４０番アミノ酸（EUナンバリング）までの配列中の任意の位置に挿入される、（１４）に記載のリガンド結合分子。
（１６）前記切断サイト、または前記プロテアーゼ切断配列、またはプロテアーゼ切断配列と第一可動リンカー、またはプロテアーゼ切断配列と第一可動リンカーと第二可動リンカーは、抗体軽鎖定常領域１０８番アミノ酸（EUナンバリング）（Kabatナンバリング１０８番）から抗体軽鎖定常領域１３１番アミノ酸（EUナンバリング）（Kabatナンバリング１３１番）までの配列中の任意の位置に挿入される、（１４）に記載のリガンド結合分子。
（１７）前記切断サイト、または前記プロテアーゼ切断配列、またはプロテアーゼ切断配列と第一可動リンカー、またはプロテアーゼ切断配列と第一可動リンカーと第二可動リンカーは、前記抗体VH内もしくは前記抗体VL内に位置する、（１３）に記載のリガンド結合分子。
（１８）前記切断サイト、または前記プロテアーゼ切断配列、またはプロテアーゼ切断配列と第一可動リンカー、またはプロテアーゼ切断配列と第一可動リンカーと第二可動リンカーは、抗体VH７番アミノ酸（Kabatナンバリング）から１６番アミノ酸（Kabatナンバリング）まで、４０番アミノ酸（Kabatナンバリング）から４７番アミノ酸（Kabatナンバリング）まで、５５番アミノ酸（Kabatナンバリング）から６９番アミノ酸（Kabatナンバリング）まで、７３番アミノ酸（Kabatナンバリング）から７９番アミノ酸（Kabatナンバリング）まで、８３番アミノ酸（Kabatナンバリング）から８９番アミノ酸（Kabatナンバリング）まで、９５番アミノ酸（Kabatナンバリング）から９９番アミノ酸（Kabatナンバリング）まで、および１０１番アミノ酸（Kabatナンバリング）から１１３番アミノ酸（Kabatナンバリング）までからなる群より選択される配列中の任意位置に挿入される、（１７）に記載のリガンド結合分子。
（１９）前記切断サイト、または前記プロテアーゼ切断配列、またはプロテアーゼ切断配列と第一可動リンカー、またはプロテアーゼ切断配列と第一可動リンカーと第二可動リンカーは、抗体VL７番アミノ酸（Kabatナンバリング）から１９番アミノ酸（Kabatナンバリング）まで、３９番アミノ酸（Kabatナンバリング）から４６番アミノ酸（Kabatナンバリング）まで、４９番アミノ酸（Kabatナンバリング）から６２番アミノ酸（Kabatナンバリング）まで、および９６番アミノ酸（Kabatナンバリング）から１０７番アミノ酸（Kabatナンバリング）までからなる群より選択される配列中の任意位置に挿入される、（１７）に記載のリガンド結合分子。
（２０）前記切断サイト、または前記プロテアーゼ切断配列、またはプロテアーゼ切断配列と第一可動リンカー、またはプロテアーゼ切断配列と第一可動リンカーと第二可動リンカーは、前記抗体定常領域と前記抗体VHの境界付近、または／および前記抗体定常領域と前記抗体VLとの境界付近に位置する、（１３）に記載のリガンド結合分子。
（２１）前記切断サイト、または前記プロテアーゼ切断配列、またはプロテアーゼ切断配列と第一可動リンカー、またはプロテアーゼ切断配列と第一可動リンカーと第二可動リンカーは、抗体VH１０９番のアミノ酸（Kabatナンバリング）から抗体重鎖定常領域１２２番のアミノ酸（EUナンバリング）までの配列中の任意位置に挿入される、（２０）に記載のリガンド結合分子。
（２２）前記切断サイト、または前記プロテアーゼ切断配列、またはプロテアーゼ切断配列と第一可動リンカー、またはプロテアーゼ切断配列と第一可動リンカーと第二可動リンカーは、抗体VL１０４番のアミノ酸（Kabatナンバリング）から抗体軽鎖定常領域１１３番のアミノ酸（EUナンバリング）（Kabatナンバリング113位）までの配列中の任意位置に挿入される、（２０）に記載のリガンド結合分子。
（２３）前記リガンド結合分子中の前記抗体VLと前記抗体VHは会合しており、当該会合は前記切断サイトが切断されることにより解消される、または前記プロテアーゼ切断配列がプロテアーゼで切断されることにより解消される、（１３）から（２２）のいずれかに記載のリガンド結合分子。
（２４）前記リガンドは生物活性を有する分子であり、前記リガンド結合分子は前記リガンドとの結合で前記リガンドの生物活性を阻害する、（１）から（２３）のいずれかに記載のリガンド結合分子。
（２５）前記リガンドはサイトカインまたはケモカインである、（１）から（２４）のいずれかに記載のリガンド結合分子。
（２６）前記リガンドは、インターロイキン、インターフェロン、造血因子、TNFスーパーファミリー、ケモカイン、細胞増殖因子、及びTGF-βファミリーから選ばれるリガンドである、（１）から（２４）のいずれかに記載のリガンド結合分子。
（２７）前記リガンドはCXCL10、IL-12、PD-1、またはIL-6Rである、（１）から（２４）のいずれかに記載のリガンド結合分子。
（２８）前記リガンドはCXCL10であり、前記リガンド結合分子は抗体VHと抗体VLを含み、当該リガンド結合分子は：
(a) 配列番号：３７４となるH-CDR1、配列番号：３７５となるH-CDR2、配列番号:３７６となるH-CDR3を含む抗体VH、配列番号：３７７となるL-CDR1、配列番号：３７８となるL-CDR2、配列番号：３７９となるL-CDR3を含む抗体VL有する；または
(b) 配列番号：３８０となるH-CDR1、配列番号：３８１となるH-CDR2、配列番号:３８２となるH-CDR3を含む抗体VH、配列番号：３８３となるL-CDR1、配列番号：３８４となるL-CDR2、配列番号：３８５となるL-CDR3を含む抗体VL有する；または
(c) （a）または（ｂ）と競合する抗体VHと抗体VLを有する；または
(d) （a）または（ｂ）と同一エピトープに結合する抗体VHと抗体VLを有する、（２７）に記載のリガンド結合分子。
（２９）前記リガンド結合分子は、配列番号：４～１４、２３～２７、３３、５９、６０、および３４６～３６７で示す配列から選ばれる抗体重鎖、または配列番号：１５～２２、１１４６～１１６０、１２８２～１３８０、および１３８６～１３８９で示す配列から選ばれる抗体軽鎖を含む抗体である、（２８）に記載のリガンド結合分子。
（３０）前記リガンドはIL-12であり、前記リガンド結合分子は抗体VHと抗体VLを含み、当該リガンド結合分子は：
(a) 配列番号：３８６となるH-CDR1、配列番号：３８７となるH-CDR2、配列番号：３８８となるH-CDR3を含む抗体VH、配列番号：３８９となるL-CDR1、配列番号：３９０となるL-CDR2、配列番号：３９１となるL-CDR3を含む抗体VL有する；または
(b) （a）と競合する抗体VHと抗体VLを有する；または
(c) （a）と同一エピトープに結合する抗体VHと抗体VLを有する、（２７）に記載のリガンド結合分子。
（３１）前記リガンド結合分子は、配列番号：１４６で示す抗体重鎖を含む抗体である、（３０）に記載のリガンド結合分子。
（３２）前記リガンドはPD-1であり、前記リガンド結合分子は抗体VHと抗体VLを含み、当該リガンド結合分子は：
(a) 配列番号：３９２となるH-CDR1、配列番号：３９３となるH-CDR2、配列番号：３９４となるH-CDR3を含む抗体VH、配列番号：３９５となるL-CDR1、配列番号：３９６となるL-CDR2、配列番号：３９７となるL-CDR3を含む抗体VL有する；または
(b) （a）と競合する抗体VHと抗体VLを有する；または
(c) （a）と同一エピトープに結合する抗体VHと抗体VLを有する、（２７）に記載のリガンド結合分子。
（３３）前記リガンド結合分子は、配列番号：３０４および３０５で示す配列から選ばれる抗体重鎖、または配列番号：３０６～３１５、および３２２で示す配列から選ばれる抗体軽鎖を含む抗体である、（３２）に記載のリガンド結合分子。
（３４）前記リガンドはIL-6R（IL-6受容体）であり、前記リガンド結合分子は抗体VHと抗体VLを含み、当該リガンド結合分子は：
(a) 配列番号：３９８となるH-CDR1、配列番号：３９９となるH-CDR2、配列番号：４００となるH-CDR3を含む抗体VH、配列番号：４０１となるL-CDR1、配列番号：４０２となるL-CDR2、配列番号：４０３となるL-CDR3を含む抗体VL有する；または
(b) （a）と競合する抗体VHと抗体VLを有する；または
(c) （a）と同一エピトープに結合する抗体VHと抗体VLを有する、（２７）に記載のリガンド結合分子。
（３５）前記リガンド結合分子は、配列番号：１５３～１５６、１５７～１５９、および４０４～４７０で示す配列から選ばれる抗体重鎖、または配列番号：４７１～５３５で示す配列から選ばれる抗体軽鎖を含む抗体である、（３４）に記載のリガンド結合分子。
（３６）前記リガンド結合分子はIgG抗体である、（１）から（３５）のいずれかに記載のリガンド結合分子。
（【００１１】以降は省略されています）

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