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公開番号2025145398
公報種別公開特許公報(A)
公開日2025-10-03
出願番号2024045556
出願日2024-03-21
発明の名称ノロウイルス検出用オリゴヌクレオチド及びその用途
出願人東洋紡株式会社,国立大学法人筑波大学
代理人弁理士法人三枝国際特許事務所
主分類C12Q 1/6888 20180101AFI20250926BHJP(生化学;ビール;酒精;ぶどう酒;酢;微生物学;酵素学;突然変異または遺伝子工学)
要約【課題】ノロウイルスを検出する有用な手法等を提供すること。
【解決手段】以下の特徴(A)及び(B)を有する、ノロウイルスのGI検出用プローブ、又は、以下の特徴(C)及び(D)を有する、ノロウイルスのGII検出用プローブが開示される:
(A)特定の配列の10～85番目の塩基配列若しくはその相補的な塩基配列において連続する少なくとも15塩基の塩基配列A1、又は塩基配列A1において1～7個の塩基が置換、欠失、挿入若しくは付加した塩基配列A2を有する。
(B)5’末端又は3’末端のいずれか一方のみが標識されている。
(C)特定の配列の30～95番目の塩基配列若しくはその相補的な塩基配列において連続する少なくとも15塩基の塩基配列C1、又は塩基配列C1において1～7個の塩基が置換、欠失、挿入若しくは付加した塩基配列C2を有する。
(D)5’末端又は3’末端のいずれか一方のみが標識されている。
【選択図】なし
特許請求の範囲【請求項１】
以下の特徴（Ａ）及び（Ｂ）を有する、ノロウイルスのＧＩ検出用プローブ：
（Ａ）配列番号１の１０～８５番目の塩基配列若しくはその相補的な塩基配列において連続する少なくとも１５塩基の塩基配列Ａ１、又は塩基配列Ａ１において１～７個の塩基が置換、欠失、挿入若しくは付加した塩基配列Ａ２を有する。
（Ｂ）５’末端又は３’末端のいずれか一方のみが標識されている。
続きを表示（約 1,000 文字）【請求項２】
前記（Ａ）の塩基配列の長さが１５～３０塩基である、請求項１に記載のプローブ。
【請求項３】
前記（Ａ）の塩基配列が、配列番号２～１０のいずれかで示される塩基配列Ａ３若しくはその相補的な塩基配列Ａ４、又は塩基配列Ａ３若しくはＡ４において１～５個の塩基が置換、欠失、挿入若しくは付加した塩基配列Ａ５を含む、請求項１に記載のプローブ。
【請求項４】
前記（Ｂ）の標識が蛍光色素標識である、請求項１に記載のプローブ。
【請求項５】
前記（Ｂ）の標識が、前記プローブの塩基配列に対して相補的な塩基配列と７０％以上の同一性を示す塩基配列を含む核酸と結合した場合に消光する蛍光消光色素による標識である、請求項１に記載のプローブ。
【請求項６】
前記（Ｂ）の標識が、グアニンとの相互作用により消光する蛍光消光色素による標識である、請求項１に記載のプローブ。
【請求項７】
前記（Ｂ）の標識が、フルオレセイン及びその誘導体、ローダミン及びその誘導体、並びにＢＯＤＩＰＹ及びその誘導体からなる群より選択される少なくとも１つの蛍光消光色素による標識である、請求項１に記載のプローブ。
【請求項８】
前記（Ｂ）の標識が、４，４－ジフルオロ－５，７－ジメチル－４－ボラ－３ａ，４ａ－ジアザ－ｓ－インダセン－３－プロピオン酸（ＢＯＤＩＰＹ－ＦＬ）、カルボキシローダミン６Ｇ、ＴＡＭＲＡ、ローダミン６Ｇ、テトラブロモスルホンフルオレセイン（ＴＢＳＦ）、及び２－オキソ－６，８－ジフルオロ－７－ジヒドロキシ－２Ｈ－１－ベンゾピラン－３－カルボン酸（ＰａｃｉｆｉｃＢｌｕｅ）からなる群より選択される少なくとも１つの蛍光消光色素による標識である、請求項１に記載のプローブ。
【請求項９】
前記（Ｂ）において、標識されている末端塩基がシトシンである、請求項１に記載のプローブ。
【請求項１０】
以下の特徴（Ｃ）及び（Ｄ）を有する、ノロウイルスのＧII検出用プローブ：
（Ｃ）配列番号１１の３０～９５番目の塩基配列若しくはその相補的な塩基配列において連続する少なくとも１５塩基の塩基配列Ｃ１、又は塩基配列Ｃ１において１～７個の塩基が置換、欠失、挿入若しくは付加した塩基配列Ｃ２を有する。
（Ｄ）５’末端又は３’末端のいずれか一方のみが標識されている。
（【請求項１１】以降は省略されています）
発明の詳細な説明【技術分野】
【０００１】
本発明は、試料中に含まれ得るノロウイルス（Norovirus：NV）を検出するためのオリゴヌクレオチド等に関する。更に、本発明は、該オリゴヌクレオチドを用いて、試料中に含まれ得るノロウイルスを検出する方法及びその方法に用いるための試薬及びキット等に関する。
続きを表示（約 5,400 文字）【背景技術】
【０００２】
ノロウイルスは、ウイルス性胃腸炎の主原因とされるウイルスで、毎年１２月～１月をピークに冬季に流行する。国内の食中毒の中では最も多くの患者を出しており、年間の食中毒患者の３０％以上を占める。ノロウイルスはヒトの腸管内で増殖し、便や嘔吐とともに排泄されるためトイレに存在していることが多い。ノロウイルスを含む生の二枚貝を食べる、もしくはノロウイルスに感染した調理者によって汚染された食品を食べることでノロウイルスに感染する。
【０００３】
さらに、ノロウイルスは遺伝子型によりＧＩ～ＧＶの５群に分類されるがヒトに感染するのは主にＧＩとＧIIである。ノロウイルスの検査は、国立感染症研究所より公開されているノロウイルスに関する病原体検出マニュアルにてＧＩとＧIIの検出を目的としたダブル標識核酸プローブ（Ｔａｑｍａｎプローブ、加水分解プローブ等とも呼ばれる）を用いたリアルタイムＰＣＲ法も公開されている。（非特許文献１）
【先行技術文献】
【非特許文献】
【０００４】
国立感染症研究所, 病原体検出マニュアルノロウイルス, 第１版, 令和元年６月公開
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００５】
非特許文献１に記載のリアルタイムＰＣＲ法では、定量的な検出も可能であるが、ＰＣＲのサイクル毎に測光する必要があるため、最も短い場合でも検出に約１時間を要する。
【０００６】
核酸増幅産物を検出する方法として、融解曲線解析法が知られている。融解曲線解析法は、核酸増幅と検出を別工程で実施することができ、最短３０分間程度で比較的簡便に測定が可能である。さらに蛍光標識核酸プローブを用いた融解曲線解析は、自動分析装置を利用した遺伝子検査にも適合させ易いという利点がある。しかし未だ、融解曲線解析法で高感度にノロウイルスのＧＩ及び／又はＧIIを１反応中で検出可能な核酸プローブは知られていない。
【０００７】
本発明の１つの目的は、試料中に含まれ得るノロウイルスのＧＩ及び／又はＧIIを検出する有用な手法等を提供することにある。
【課題を解決するための手段】
【０００８】
本発明者らは、上記の目的を達成するため鋭意研究を行った結果、特定の核酸プローブを用いることで、ノロウイルスのＧＩ及び／又はＧIIを検出（特に１反応中でＧＩ及びＧIIを同時に検出）する有用な方法、特に簡便でありながら高感度に検出する方法を見出した。斯かる知見を基に更に検討を重ねることにより、本発明を完成した。
【０００９】
本発明は、以下の態様を包含する。
［項１］以下の特徴（Ａ）及び（Ｂ）を有する、ノロウイルスのＧＩ検出用プローブ：
（Ａ）配列番号１の１０～８５番目の塩基配列若しくはその相補的な塩基配列において連続する少なくとも１５塩基の塩基配列Ａ１、又は塩基配列Ａ１において１～７個の塩基が置換、欠失、挿入若しくは付加した塩基配列Ａ２を有する。
（Ｂ）５’末端又は３’末端のいずれか一方のみが標識されている。
［項２］前記（Ａ）の塩基配列の長さが１５～３０塩基である、項１に記載のプローブ。
［項３］前記（Ａ）の塩基配列が、配列番号２～１０のいずれかで示される塩基配列Ａ３若しくはその相補的な塩基配列Ａ４、又は塩基配列Ａ３若しくはＡ４において１～５個の塩基が置換、欠失、挿入若しくは付加した塩基配列Ａ５を含む、項１又は２に記載のプローブ。
［項４］前記（Ｂ）の標識が蛍光色素標識である、項１～３のいずれかに記載のプローブ。
［項５］前記（Ｂ）の標識が、前記プローブの塩基配列に対して相補的な塩基配列と７０％以上の同一性を示す塩基配列を含む核酸と結合した場合に消光する蛍光消光色素による標識である、項１～４のいずれかに記載のプローブ。
［項６］前記（Ｂ）の標識が、グアニンとの相互作用により消光する蛍光消光色素による標識である、項１～５のいずれかに記載のプローブ。
［項７］前記（Ｂ）の標識が、フルオレセイン及びその誘導体、ローダミン及びその誘導体、並びにＢＯＤＩＰＹ及びその誘導体からなる群より選択される少なくとも１つの蛍光消光色素による標識である、項１～６のいずれかに記載のプローブ。
［項８］前記（Ｂ）の標識が、４，４－ジフルオロ－５，７－ジメチル－４－ボラ－３ａ，４ａ－ジアザ－ｓ－インダセン－３－プロピオン酸（ＢＯＤＩＰＹ－ＦＬ）、カルボキシローダミン６Ｇ、ＴＡＭＲＡ、ローダミン６Ｇ、テトラブロモスルホンフルオレセイン（ＴＢＳＦ）、及び２－オキソ－６，８－ジフルオロ－７－ジヒドロキシ－２Ｈ－１－ベンゾピラン－３－カルボン酸（ＰａｃｉｆｉｃＢｌｕｅ）からなる群より選択される少なくとも１つの蛍光消光色素による標識である、項１～７のいずれかに記載のプローブ。
［項９］前記（Ｂ）において、標識されている末端塩基がシトシンである、項１～８のいずれかに記載のプローブ。
［項１０］以下の特徴（Ｃ）及び（Ｄ）を有する、ノロウイルスのＧII検出用プローブ：
（Ｃ）配列番号１１の３０～９５番目の塩基配列若しくはその相補的な塩基配列において連続する少なくとも１５塩基の塩基配列Ｃ１、又は塩基配列Ｃ１において１～７個の塩基が置換、欠失、挿入若しくは付加した塩基配列Ｃ２を有する。
（Ｄ）５’末端又は３’末端のいずれか一方のみが標識されている。
［項１１］前記（Ｃ）の塩基配列の長さが１５～２５塩基である、項１０に記載のプローブ。
［項１２］前記（Ｃ）の塩基配列が、配列番号１２～１５のいずれかで示される塩基配列Ｃ３若しくはその相補的な塩基配列Ｃ４、又は塩基配列Ｃ３若しくはＣ４において１～５個の塩基が置換、欠失、挿入若しくは付加した塩基配列Ｃ５を含む、項１０又は１１に記載のプローブ。
［項１３］前記（Ｄ）の標識が蛍光色素標識である、項１０～１２のいずれかに記載のプローブ。
［項１４］前記（Ｄ）の標識が、前記プローブの塩基配列に対して相補的な塩基配列と７０％以上の同一性を示す塩基配列を含む核酸と結合した場合に消光する蛍光消光色素による標識である、項１０～１３のいずれかに記載のプローブ。
［項１５］前記（Ｄ）の標識が、グアニンとの相互作用により消光する蛍光消光色素による標識である、項１０～１４のいずれかに記載のプローブ。
［項１６］前記（Ｄ）の標識が、フルオレセイン及びその誘導体、ローダミン及びその誘導体、並びにＢＯＤＩＰＹ及びその誘導体からなる群より選択される少なくとも１つの蛍光消光色素による標識である、項１０～１５のいずれかに記載のプローブ。
［項１７］前記（Ｄ）の標識が、４，４－ジフルオロ－５，７－ジメチル－４－ボラ－３ａ，４ａ－ジアザ－ｓ－インダセン－３－プロピオン酸（ＢＯＤＩＰＹ－ＦＬ）、カルボキシローダミン６Ｇ、ＴＡＭＲＡ、ローダミン６Ｇ、テトラブロモスルホンフルオレセイン（ＴＢＳＦ）、及び２－オキソ－６，８－ジフルオロ－７－ジヒドロキシ－２Ｈ－１－ベンゾピラン－３－カルボン酸（ＰａｃｉｆｉｃＢｌｕｅ）からなる群より選択される少なくとも１つの蛍光消光色素による標識である、項１０～１６のいずれかに記載のプローブ。
［項１８］前記（Ｄ）において、標識されている末端塩基がシトシンである、項１０～１７のいずれかに記載のプローブ。
［項１９］項１～９のいずれかに記載のプローブ及び項１０～１８のいずれかに記載のプローブを用いて、試料中に含まれ得るノロウイルスのＧＩ及び／又はＧIIを１反応中で検出する方法。
［項２０］以下の工程（１）、（２）、及び（３）：
（１）ノロウイルスのＧＩ及び／又はＧIIを含み得る試料を提供する工程、
（２）工程（１）で提供された試料を含有する反応液において核酸増幅反応を行う工程、及び
（３）工程（２）の核酸増幅反応で得られた１又は複数の核酸増幅産物を、項１～９のいずれかに記載の１又は複数のプローブ及び項１０～１８のいずれかに記載の１又は複数のプローブを用いて検出する工程、
を含む、項１９に記載の方法。
［項２１］前記工程（２）がＰＣＲ反応により実施され、前記ＰＣＲ反応に用いる核酸増幅酵素が、ファミリーＢに属するＤＮＡポリメラーゼである、項２０に記載の方法。
［項２２］前記ファミリーＢに属するＤＮＡポリメラーゼが、ＫＯＤ由来のＤＮＡポリメラーゼ又はその変異体である、項２１に記載の方法。
［項２３］前記工程（２）の核酸増幅反応で使用するノロウイルスのＧＩ検出用プライマーセットが、配列番号１の１～３５番目の塩基配列又はその相補的な塩基配列において連続する少なくとも２０塩基の塩基配列Ｓ１又は前記塩基配列Ｓ１において１～５個の塩基が置換、欠失、挿入若しくは付加した塩基配列Ｓ２を有する第一のＧＩ検出用プライマーと、配列番号１の６０～９５番目の塩基配列又はその相補的な塩基配列において連続する少なくとも２０塩基の塩基配列Ｓ３又は前記塩基配列Ｓ３において１～５個の塩基が置換、欠失、挿入若しくは付加した塩基配列Ｓ４を有する第二のＧＩ検出用プライマーとを含み、第二のＧＩ検出用プライマーが第一のＧＩ検出用プライマーのＤＮＡ伸長生成物に対して相補的である、項２０～２２のいずれかに記載の方法。
［項２４］前記第一のＧＩ検出用プライマーが、配列番号１６及び１７のいずれかで示される塩基配列Ｓ１１若しくはその相補的な塩基配列Ｓ１２、又は塩基配列Ｓ１１若しくはＳ１２において１～５個の塩基が置換、欠失、挿入若しくは付加した塩基配列Ｓ２１を有し、かつ、前記第二のＧＩ検出用プライマーが、配列番号１８及び１９のいずれかで示される塩基配列Ｓ３１若しくはその相補的な塩基配列Ｓ３２、又は塩基配列Ｓ３１若しくはＳ３２において１～５個の塩基が置換、欠失、挿入若しくは付加した塩基配列Ｓ４１を有する、項２３に記載の方法。
［項２５］前記工程（２）の核酸増幅反応で使用するノロウイルスのＧII検出用プライマーセットが、配列番号１１の１～５０番目の塩基配列又はその相補的な塩基配列において連続する少なくとも２０塩基の塩基配列Ｓ５又は前記塩基配列Ｓ５において１～５個の塩基が置換、欠失、挿入若しくは付加した塩基配列Ｓ６を有する第一のＧII検出用プライマーと、配列番号１１の８０～１０７番目の塩基配列又はその相補的な塩基配列において連続する少なくとも１８塩基の塩基配列Ｓ７又は前記塩基配列Ｓ７において１～５個の塩基が置換、欠失、挿入若しくは付加した塩基配列Ｓ８を有する第二のＧII検出用プライマーとを含むプライマーセットであって、第二のＧII検出用プライマーが第一のＧII検出用プライマーのＤＮＡ伸長生成物に対して相補的である、項２０～２４のいずれかに記載の方法。
［項２６］前記第一のＧII検出用プライマーが、配列番号２０～２３のいずれかで示される塩基配列Ｓ５１若しくはその相補的な塩基配列Ｓ５２、又は塩基配列Ｓ５１若しくはＳ５２において１～５個の塩基が置換、欠失、挿入若しくは付加した塩基配列Ｓ６１を有し、かつ、前記第二のＧII検出用プライマーが、配列番号２４及び２５のいずれかで示される塩基配列Ｓ７１若しくはその相補的な塩基配列Ｓ７２、又は塩基配列Ｓ７１若しくはＳ７２において１～５個の塩基が置換、欠失、挿入若しくは付加した塩基配列Ｓ８１を有する、項２５に記載の方法。
［項２７］前記工程（３）の検出する工程が、融解曲線分析により実施される、項２０～２６のいずれかに記載の方法。
［項２８］項１～９のいずれかに記載のプローブ及び項１０～１８のいずれかに記載のプローブを含む、ノロウイルスのＧＩ及び／又はＧIIを１反応中で検出するためのキット。
［項２９］項２３又は２４に記載のプライマーセット及び項２５又は２６に記載のプライマーセットを含む、ノロウイルスのＧＩ及び／又はＧIIを１反応中で検出するためのキット。
［項３０］項１～９のいずれかに記載のプローブ、項１０～１８のいずれかに記載のプローブ、項２３又は２４に記載のプライマーセット、及び項２５又は２６に記載のプライマーセットを含む、ノロウイルスのＧＩ及び／又はＧIIを１反応中で検出するためのキット。
【発明の効果】
【００１０】
本発明により、試料中に含まれ得るノロウイルスのＧＩ及び／又はＧIIを検出する有用な手法等を提供できる。
【図面の簡単な説明】
（【００１１】以降は省略されています）

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