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公開番号2025106467
公報種別公開特許公報(A)
公開日2025-07-15
出願番号2025064241,2023076625
出願日2025-04-09,2018-11-28
発明の名称乳癌の検出
出願人マヨファウンデーションフォアメディカルエデュケーションアンドリサーチ,Mayo Foundation for Medical Education and Research,エグザクトサイエンシーズコーポレーション
代理人弁理士法人 HARAKENZO WORLD PATENT & TRADEMARK
主分類C12Q 1/6886 20180101AFI20250708BHJP(生化学;ビール;酒精;ぶどう酒;酢;微生物学;酵素学;突然変異または遺伝子工学)
要約【課題】乳癌の存在を検出するための方法を提供する。
【解決手段】ヒト個体の生体試料中において、乳癌組織と良性の乳房組織とを区別できる新規DNAメチル化マーカー及び/またはマーカーのパネルから選択される、1つ以上の遺伝子に関するCpG部位のメチル化レベルを測定する方法である。
【選択図】なし
特許請求の範囲【請求項１】
生体試料を特徴付ける方法であって、
（ａ）ヒト個体の生体試料中において、ＢＨＬＨＥ２３＿Ｃ、ＣＡＬＮ１＿Ａ、ＣＤ１Ｄ、ＨＯＸＡ７＿Ａ、ＬＯＣ１００１３２８９１、ＭＡＸ．ｃｈｒ１．８２７７４７９－８２７７５２７、ＭＡＸ．ｃｈｒ１５．９６８８９０１３－９６８８９１２８、ＮＡＣＡＤ、ＡＴＰ６Ｖ１Ｂ１、ＢＡＮＫ１、Ｃ１７ｏｒｆ６４、ＤＬＸ４、ＥＭＸ１＿Ａ、ＦＯＸＰ４、ＧＰ５、ＩＴＰＲＩＰＬ１、ＬＭＸ１Ｂ＿Ａ、ＭＡＸ．ｃｈｒ１１．１４９２６６０２－１４９２７１４８、ＭＡＸ．ｃｈｒ５．４２９９４８６６－４２９９４９３６、ＭＡＸ．ｃｈｒ８．１２４１７３０３０－１２４１７３３９５、ＭＰＺ、ＰＲＫＣＢ、ＳＴＸ１６＿ＢＵＢＴＦ、ＬＯＣ１００１３２８９１、ＩＴＰＲＩＰＬ１、ＡＢＬＩＭ１、ＭＡＸ．ｃｈｒ１９．４６３７９９０３－４６３８０１９７、ＺＳＣＡＮ１２、ＢＨＬＨＥ２３＿Ｄ、ＣＸＣＬ１２、ＫＣＮＫ９、ＯＴＸ１、ＲＩＣ３、ＳＣＲＴ２＿Ｂ、ＭＡＸ．ｃｈｒ１７．７３０７３６８２－７３０７３８１４、ＣＤＨ４＿Ｅ、ＨＮＦ１Ｂ＿Ｂ、ＴＲＨ＿Ａ、ＭＡＸ．ｃｈｒ２０．１７８４２０９－１７８４４６１、ＭＡＸ．ｃｈｒ５．１４５７２５４１０－１４５７２５４５９、ＭＡＸ．ｃｈｒ５．７７２６８６７２－７７２６８７２５、ＢＥＳＴ４、及びＤＳＣＲ６から選択される１つ以上の遺伝子に関するＣｐＧ部位のメチル化レベルを測定し、その手段とは、
前記生体試料中のゲノムＤＮＡを亜硫酸水素塩で処理すること、
前記選択された１つ以上の遺伝子に関するプライマーのセットを使用して、前記亜硫酸水素塩処理ゲノムＤＮＡを増幅すること、及び
メチル化特異的ＰＣＲ、定量メチル化特異的ＰＣＲ、メチル化感受性ＤＮＡ制限酵素分析、定量亜硫酸水素塩パイロシーケンシング、または亜硫酸水素塩ゲノムシーケンシングＰＣＲによって、前記ＣｐＧ部位の前記メチル化レベルを決定すること、
（ｂ）前記メチル化レベルを、乳癌を有しない対照試料中の対応する遺伝子セットのメチル化レベルと比較すること、ならびに
（ｃ）前記１つ以上の遺伝子中で測定される前記メチル化レベルが、各々の前記対照試料中で測定される前記メチル化レベルよりも高い場合に、前記個体がＢＲＣＡ１癌を有すると決定することを含む、前記方法。

発明の詳細な説明【技術分野】
【０００１】
関連出願に対する相互参照
本出願は、２０１７年１１月３０日出願の米国仮特許出願第６２／５９２，８２８号に対する優先権及びその利益を主張し、その内容全体が参照によって本明細書に組み込まれる。
続きを表示（約 2,900 文字）【０００２】
本明細書で提供されるのは、乳癌スクリーニングに関する技術であり、特に、乳癌の存在を検出するための方法、組成物、及び関連用途であるが、これらに限らない。
【背景技術】
【０００３】
乳癌は、年間およそ２３０，０００人の米国女性に影響を及ぼし、毎年約４０，０００人の命を奪う。ＢＲＣＡ１及びＢＲＣＡ２遺伝子の生殖細胞系列変異の保因者は乳癌のリスクが高いことが知られているが、乳癌に罹患する大半の女性は、これらの遺伝子のうち１つに変異を有しておらず、乳癌のリスクが高い女性を正確に同定する能力には限界がある。効果的な予防療法が存在するが、現在のリスク予測モデルは、乳癌のリスクが高い女性の大多数を正確に同定しない（例えば、ＰａｎｋｒａｔｚＶＳ，ｅｔａｌ．，ＪＣｌｉｎＯｎｃｏｌ２００８Ｎｏｖ２０；２６（３３）：５３７４－９を参照のこと）。
【０００４】
乳癌を検出するための改良された方法が必要である。
【０００５】
本発明は、これらの必要性に対処する。
【発明の概要】
【０００６】
メチル化ＤＮＡは、ほとんどの腫瘍型の組織中におけるバイオマーカーの有力なクラスとして研究されている。多くの例において、ＤＮＡメチルトランスフェラーゼは、遺伝子発現のエピジェネティック制御として、シトシン－リン酸－グアニン（ＣｐＧ）アイランド部位でＤＮＡにメチル基を付加する。生物学的に興味深い機序では、腫瘍抑制遺伝子のプロモーター領域における後天的メチル化事象は、発現をサイレンシングし、それゆえ発がんに寄与すると考えられている。ＤＮＡメチル化は、ＲＮＡまたはタンパク質発現よりも、より化学的かつ生物学的に安定した診断ツールである可能性がある（Ｌａｉｒｄ（２０１０）ＮａｔＲｅｖＧｅｎｅｔ１１：１９１－２０３）。さらに、散発性結腸癌のような他のがんでは、メチル化マーカーは、優れた特異性を提供し、個別のＤＮＡ変異であるものよりも、より広範な情報を有し、かつ感度が高い（Ｚｏｕｅｔａｌ（２００７）ＣａｎｃｅｒＥｐｉｄｅｍｉｏｌＢｉｏｍａｒｋｅｒｓＰｒｅｖ１６：２６８６－９６）。
【０００７】
ＣｐＧアイランドの分析は、動物モデル及びヒト細胞株に使用される場合、重要な知見をもたらしている。例えば、Ｚｈａｎｇ及び同僚らは、同じＣｐＧアイランドの異なる部分からのアンプリコンが、異なるレベルのメチル化を有する可能性があることを見出した（Ｚｈａｎｇｅｔａｌ．（２００９）ＰＬｏＳＧｅｎｅｔ５：ｅ１０００４３８）。さらに、メチル化レベルは、高度なメチル化配列と非メチル化配列との間で二峰性に分布し、さらにＤＮＡメチルトランスフェラーゼ活性のバイナリースイッチ様パターンを支持していた（Ｚｈａｎｇｅｔａｌ．（２００９）ＰＬｏＳＧｅｎｅｔ５：ｅ１０００４３８）。インビボのマウス組織及びインビトロの細胞株の分析は、高ＣｐＧ密度のプロモーター（ＨＣＰ、３００塩基対領域内で＞７％のＣｐＧ配列を有すると定義される）の約０．３％のみがメチル化されたのに対して、低ＣｐＧ密度の領域（ＬＣＰ、３００塩基対領域内で＜５％のＣｐＧ配列を有すると定義される）は、動的組織特異的パターンにおいて高い頻度でメチル化される傾向があったことを実証した（Ｍｅｉｓｓｎｅｒｅｔａｌ．（２００８）Ｎａｔｕｒｅ４５４：７６６－７０）。ＨＣＰは、遍在性ハウスキーピング遺伝子及び高度に制御された発生遺伝子のためのプロモーターを含む。＞５０％においてメチル化されたＨＣＰ部位の中でも、いくつかの確立されたマーカー、例えば、Ｗｎｔ２、ＮＤＲＧ２、ＳＦＲＰ２、及びＢＭＰ３などがあった（Ｍｅｉｓｓｎｅｒｅｔａｌ．（２００８）Ｎａｔｕｒｅ４５４：７６６－７０）。
【０００８】
ＤＮＡメチルトランスフェラーゼによるシトシン－リン酸－グアニン（ＣｐＧ）アイランド部位におけるＤＮＡのエピジェネティックメチル化は、ほとんどの腫瘍型の組織中におけるバイオマーカーの有力なクラスとして研究されている。生物学的に興味深い機序では、腫瘍抑制遺伝子のプロモーター領域における後天的メチル化事象は、発現をサイレンシングし、発がんに寄与すると考えられている。ＤＮＡメチル化は、ＲＮＡまたはタンパク質発現よりも、より化学的かつ生物学的に安定した診断ツールである可能性がある。さらに、散発性結腸癌のような他のがんでは、異常なメチル化マーカーは、個別のＤＮＡ変異であるものよりも、より広範な情報を有し、かつ感度が高く、優れた特異性を提供する。
【０００９】
いくつかの方法が、新規メチル化マーカーを探索するのに利用可能である。ＣｐＧメチル化のマイクロアレイに基づく照合は、合理的で高スループットなアプローチであるが、この方針は、既知の目的の領域、主に確立された腫瘍抑制プロモーターに偏っている。ＤＮＡメチル化のゲノムワイド解析の代替方法は、この１０年間で開発されている。３つの基本的なアプローチが存在する。第１には、特定のメチル化部位を認識する制限酵素によってＤＮＡの消化を用い、続いていくつかの可能な分析技術を用いて、酵素認識部位またはプライマーに限定されたメチル化データを提供し、これらを使用して定量化ステップにおいてＤＮＡを増幅する（メチル化特異的ＰＣＲ、ＭＳＰなど）。第２アプローチは、メチル－シトシンまたは他のメチル化特異的結合ドメインを対象とする抗体を使用してゲノムＤＮＡのメチル化画分を濃縮し、続いてマイクロアレイ分析またはシーケンシングを行って、断片を基準ゲノムにマッピングする。このアプローチは、断片内における全てのメチル化部位の単一ヌクレオチド分解能を提供しない。第３アプローチは、ＤＮＡの亜硫酸水素塩処理に始まって全ての非メチル化チロシンをウラシルに変換し、続いて制限酵素消化を行い、アダプターリガンドへの結合後に全ての断片の完全シーケンシングを行う。制限酵素の選択によって、ＣｐＧ高密度領域の断片が濃縮され、分析中に複数の遺伝子位置にマッピングされる可能性のある冗長配列数が減少し得る。
【００１０】
ＲＲＢＳは、中程度～高いリードカバレッジで全てのＣｐＧアイランド及び大部分の腫瘍抑制プロモーターの８０～９０％に関する、単一ヌクレオチド分解能でのＣｐＧメチル化状態データをもたらす。がん症例－対照研究では、これらのリードの分析は、可変メチル化領域（ＤＭＲ）の同定をもたらす。膵臓癌検体に関するこれまでのＲＲＢＳ分析では、何百ものＤＭＲが発見され、その多くは発がんとは決して関連せず、その多くはアノテーションされなかった。独立した組織試料セットに対するさらなる検証試験は、性能の点で１００％の感度及び特異性であったマーカーＣｐＧを確認した。
（【００１１】以降は省略されています）

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