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公開番号2025117582
公報種別公開特許公報(A)
公開日2025-08-13
出願番号2024012114
出願日2024-01-30
発明の名称酸性脂質の回収方法
出願人株式会社島津製作所,株式会社ファイトリピッド・テクノロジーズ
代理人弁理士法人深見特許事務所
主分類C11B 11/00 20060101AFI20250804BHJP(動物性または植物性油,脂肪,脂肪性物質またはろう;それに由来する脂肪酸;洗浄剤;ろうそく)
要約【課題】簡便で且つ確実な、酸性脂質の回収方法を提供すること。
【解決手段】酸性脂質の回収方法であって、上記酸性脂質を含む試料を準備する、準備工程と、準備した上記試料を強陰イオン交換カラムに適用する、適用工程と、洗浄溶液を上記強陰イオン交換カラムに適用する、洗浄工程と、溶出溶液を上記強陰イオン交換カラムに適用して、上記酸性脂質を回収する、回収工程と、を含む、酸性脂質の回収方法。
【選択図】なし
特許請求の範囲【請求項１】
酸性脂質の回収方法であって、
前記酸性脂質を含む試料を準備する、準備工程と、
準備した前記試料を強陰イオン交換カラムに適用する、適用工程と、
洗浄溶液を前記強陰イオン交換カラムに適用する、洗浄工程と、
溶出溶液を前記強陰イオン交換カラムに適用して、前記酸性脂質を回収する、回収工程と、
を含む、酸性脂質の回収方法。
続きを表示（約 790 文字）【請求項２】
前記強陰イオン交換カラムの固定相は、第四級アンモニウム基を有する、請求項１に記載の酸性脂質の回収方法。
【請求項３】
前記酸性脂質は、ホスファチジルグリセロール、ホスファチジルイノシトール、スルホキノボシルジアシルグリセロール及びホスファチジン酸からなる群より選ばれる少なくとも１種を含む、請求項１又は請求項２に記載の酸性脂質の回収方法。
【請求項４】
前記洗浄溶液は、２－プロパノールと、揮発性塩の緩衝液とを含む、請求項１又は請求項２に記載の酸性脂質の回収方法。
【請求項５】
前記溶出溶液は、２－プロパノールと、塩化アンモニウム、硫酸アンモニウム、クエン酸アンモニウム又は硝酸アンモニウムとを含む、請求項１又は請求項２に記載の酸性脂質の回収方法。
【請求項６】
前記試料は、植物由来である、請求項１又は請求項２に記載の酸性脂質の回収方法。
【請求項７】
前記洗浄工程において、前記強陰イオン交換カラムを通過した前記洗浄溶液を採取することを更に含む、請求項１又は請求項２に記載の酸性脂質の回収方法。
【請求項８】
試料中の酸性脂質を分析する方法であって、
請求項１又は請求項２に記載の酸性脂質の回収方法によって、前記試料から回収した前記酸性脂質を含む分析用試料を得る、試料取得工程と、
前記分析用試料を液体クロマトグラフで成分ごとに分離する、分離工程と、
分離された前記成分を質量分析装置で分析する、分析工程と、
を含む、試料中の酸性脂質を分析する方法。
【請求項９】
酸性脂質を回収するためのキットであって、
強陰イオン交換カラムと、
洗浄溶液と、
溶出溶液と、
を含む、キット。

発明の詳細な説明【技術分野】
【０００１】
本発明は、酸性脂質の回収方法に関する。
続きを表示（約 2,100 文字）【背景技術】
【０００２】
生体膜を構成する脂質は、単純脂質、複合脂質から成り、後者にはリン脂質、糖脂質が含まれる。リン脂質、糖脂質には、グリセロール骨格を持つグリセロ脂質と、スフィンゴイド塩基を持つスフィンゴ脂質から成り、グリセロ脂質には、ホスファチジルコリン、ホスファチジルエタノールアミン、ホスファチジルセリン等の主要なリン脂質（グリセロリン脂質）が含まれる。これらの脂質は、生体を維持する構造体としてだけでなく、生理活性に関わる機能成分としても重要な役割を担っている。それ故、微量で且つ簡便に測定でき、ハイスループット対応可能な分析方法の開発が求められている。
【先行技術文献】
【特許文献】
【０００３】
特開２００８－１５６５７１号公報
【非特許文献】
【０００４】
Trinidad Perez-Palacios, Jorge Ruiz, Teresa Antequera. Improvement of a solid phase extraction method for separation of animal muscle phospholipid classes. Food Chem. 2007, 102, 875-879.
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００５】
従来法では、原則として、植物の葉などの生体試料から溶媒抽出法（例えば、Ｂｌｉｇｈ＆Ｄｙｅｒ法、ＭＴＢＥ法、ＢＵＭＥ法など）によって脂質を含む抽出液を得て、得られた抽出液をそのまま質量分析計等で測定している（図１）。しかしながら、生体試料に含まれている脂質は、その種類によって濃度に大きな違いがある。そのため、低濃度の脂質が検出困難になる傾向がある。例えば、シロイヌナズナには、ホスファチジルコリン（ＰＣ）、ホスファチジルエタノールアミン（ＰＥ）、ホスファチジルグリセロール（ＰＧ）、ホスファチジルイノシトール（ＰＩ）等が含まれるが、ＰＣ、ＰＥの濃度と比較して、ＰＧ及びＰＩ等の酸性脂質の濃度が低く、これら４種類の脂質を同時に定量すると、定量精度に限界がある（図２）。このような事情により、質量分析装置による測定では、脂質の種類間の感度差、生体内での各脂質の種類毎の濃度差が大きく、質量分析を適用するにしても大きく制限がかかる。また、脂質の定量にはガスクロマトグラフィーも用いられるが、ガスクロマトグラフィーでは脂質から切り出された脂肪酸メチルエステルを検出するため、脂肪酸がどの種類の脂質に由来するかが分からず、脂質の分画が必須となる。そのため、脂質成分を種類毎に分画して、分画した種類毎に定量、分析することが試みられている。
【０００６】
従来法として、脂質の分画には固相抽出によりリン脂質を分画する方法や、クロロホルム、メタノールを主とする混合溶媒などを用いて薄層クロマトグラフィー（ＴＬＣ）で二次元展開し、脂質を種類毎に完全に分画する方法などが知られている。
【０００７】
固相抽出を用いた方法は、非特許文献１のようにアミノプロピル基を有する固相が充填されたカラム（「陰イオン交換カラム」、「アミノプロピルカラム」と記載する場合がある。）を用いる方法が知られている。この方法ではコンディショニングされたアミノプロピルカラムに脂質を含む試料を添加したのち、（１）アセトニトリル：１－プロパノール（体積比２：１）、（２）メタノール、（３）２－プロパノール：３Ｎ塩酸メタノール（体積比４：１）、（４）クロロホルム：メタノール：３Ｎ塩酸（体積比２００：１００：１）で順番に溶出することによって、リン脂質であるホスファチジルコリン、ホスファチジルエタノールアミン、ホスファチジルセリン、ホスファチジルイノシトールをそれぞれ分画している（例えば、図３）。しかしながら、アミノプロピルカラムを用いた固相抽出では親水性相互作用、疎水性相互作用、静電相互作用の複合的な作用を用いて分画を行うため、固相の量、並びに、用いる溶媒の組成及び量を厳密に制御する必要がある（例えば、図３）。そのため作業上の僅かな違いが分画の成否に影響を与える可能性があり、都度検証する必要がある。
【０００８】
また、特許文献１のように酸化金属を用いてリン脂質およびガングリオシドとそれ以外を分画する方法が知られている。しかしながら、非特許文献１と同様に、生体内の各脂質成分の濃度差を解消することができず、低濃度の脂質が測定時に検出困難になる傾向がある。
【０００９】
一方で、ＴＬＣを用いる脂質の分画は、個々の脂質を種類毎に分画できるものの時間効率が極めて低く、さらに大気中の湿度の影響を強く受けるため再現性に課題がある。
【００１０】
本発明は、上記事情に鑑みてなされたものであり、簡便で且つ確実な、酸性脂質の回収方法を提供することを目的とする。
【課題を解決するための手段】
（【００１１】以降は省略されています）

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