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公開番号2025126890
公報種別公開特許公報(A)
公開日2025-08-29
出願番号2024230148
出願日2024-12-26
発明の名称改変型バソプレシン受容体を発現する培養細胞
出願人ヤマサ醤油株式会社,国立大学法人東北大学
代理人弁理士法人特許事務所サイクス
主分類C12N 5/10 20060101AFI20250822BHJP(生化学;ビール;酒精;ぶどう酒;酢;微生物学;酵素学;突然変異または遺伝子工学)
要約【課題】高感度にAVPを測定でき、かつDDAVPの影響を排除して測定する方法、およびAVP受容体を提供する。
【解決手段】高感度な受容体であるカモノハシV2受容体の野生型または変異体を発現させた培養細胞を用いる。また、カモノハシV2受容体のアミノ酸配列に点変異を導入することにより、DDAVPによる受容体の活性化を低減させる。
【選択図】図3
特許請求の範囲【請求項１】
下記のいずれか一のタンパク質を発現する、培養細胞：
(1)配列番号1のアミノ酸配列からなるタンパク質；
(2)配列番号1のアミノ酸配列において、126番目相当がフェニルアラニン（F）、126番目相当がアスパラギン(N)、126番目相当がチロシン（Y）、129番目相当がアラニン（A）、205番目相当がN、214番目相当がA以外のアミノ酸、及び218番目相当がグルタミン酸（E）以外のアミノ酸からなる群より選択される少なくとも一つの変異を有するアミノ酸配列からなるタンパク質；
(3)(1)又は(2)に記載のタンパク質のアミノ酸配列と少なくとも90％の同一性を有するアミノ酸配列からなり、かつAVP受容体活性を有する、タンパク質；
(4)(1)又は(2)に記載のタンパク質のアミノ酸配列と少なくとも75％の同一性を有するアミノ酸配列であって、ただし219～333番目相当部分は少なくとも95％の同一性を有するアミノ酸配列からなり、かつAVP受容体活性を有する、タンパク質；
(5)(1)～(4)に記載のタンパク質のアミノ酸配列において、334～339番目相当部分が配列番号19のアミノ酸配列である、タンパク質。
続きを表示（約 1,000 文字）【請求項２】
下記のいずれか一のタンパク質：
(2)配列番号1のアミノ酸配列において、126番目相当がフェニルアラニン（F）、126番目相当がアスパラギン(N)、126番目相当がチロシン（Y）、129番目相当がアラニン（A）、205番目相当がN、214番目相当がA以外のアミノ酸、及び218番目相当がグルタミン酸（E）以外のアミノ酸からなる群より選択される少なくとも一つの変異を有するアミノ酸配列からなるタンパク質；
(3')配列番号1又は(2)に記載のタンパク質のアミノ酸配列と少なくとも90％の同一性を有するアミノ酸配列(ただし配列番号1のアミノ酸配列は除く。)からなり、かつAVP受容体活性を有する、タンパク質；
(4')配列番号1又は(2)に記載のタンパク質のアミノ酸配列と少なくとも75％の同一性を有するアミノ酸配列(ただし配列番号1のアミノ酸配列は除く。)であって、ただし219～333番目相当部分は少なくとも95％の同一性を有するアミノ酸配列からなり、かつAVP受容体活性を有する、タンパク質；
(5)(2)、(3')、及び(4')に記載のタンパク質のアミノ酸配列において、334～339番目相当部分が配列番号19のアミノ酸配列である、タンパク質。
【請求項３】
さらにｃＡＭＰバイオセンサーを発現する、請求項１に記載の培養細胞。
【請求項４】
請求項２に記載のタンパク質をコードするポリヌクレオチド。
【請求項５】
請求項１又は請求項３に記載の培養細胞を含有する、ＡＶＰ測定用キット。
【請求項６】
体外診断用医薬品である、請求項５に記載のキット。
【請求項７】
下記の工程を含む、試料中のＡＶＰレベルの分析方法：
(a)試料を、ＡＶＰ受容体を発現する培養細胞に添加してインキュベートし、
このときＡＶＰ受容体は、1-デアミノ-8-D-アルギニンバソプレシン（ＤＤＡＶＰ）による活性化が抑制され、ＡＶＰ選択的に活性化されるものであり；
(b)インキュベート後のＡＶＰ受容体の活性化レベルを分析し；
(c)得られた分析結果に基づき、ＤＤＡＶＰの影響の低減されたＡＶＰレベルを分析する、方法であって、
ＡＶＰ受容体が、請求項１に定義されたタンパク質、又は請求項２に記載のタンパク質である、方法。

発明の詳細な説明【技術分野】
【０００１】
本発明は、アルギニンバソプレシン（ＡＶＰ；ＡｒｇｉｎｉｎｅＶａｓｏｐｒｅｓｓｉｎ）に起因する下垂体疾患の判定が可能な、ＡＶＰの測定方法及びキットに関する。
続きを表示（約 1,900 文字）【背景技術】
【０００２】
ＡＶＰは、視床下部で合成され、下垂体後葉に運ばれたのちに分泌されるペプチドホルモンである。ＡＶＰは腎集合尿細管細胞に存在するバソプレシン受容体（Ｖ２受容体）に作用し、水の再吸収を促進することで尿量を少なくするため、抗利尿ホルモン（ＡＤＨ；ＡｎｔｉｄｉｕｒｅｔｉｃＨｏｒｍｏｎｅ）とも呼ばれる。
【０００３】
中枢性尿崩症はＡＶＰの分泌が完全にもしくは部分的に欠損することを原因とする疾患であり、ＡＶＰの分泌が正常に行われないために腎臓における尿の再吸収が正常に行われないことで多飲及び多尿といった症状を示す。バソプレシンの分泌異常を原因とする疾患として、中枢神経疾患によりバソプレシンの分泌が増強されること、又は腫瘍などから異所性バソプレシンが産生されることなどが原因とされる、抗利尿ホルモン不適合分泌症候群（ＳＩＡＤＨ）が知られている。また、Ｖ２受容体電子の変異によりバソプレシンへの感受性が低下することで中枢性尿崩症と類似の症状を示す腎性尿崩症も知られている。
【０００４】
中枢性尿崩症の診断には血漿中ＡＶＰ濃度の測定が有用であることが広く知られている。血漿中ＡＶＰ濃度の測定として、例えば、放射免疫測定法（ＲＩＡ；Ｒａｄｉｏｉｍｍｕｎｏａｓｓａｙ）による測定が知られている。具体的には、患者血漿に冷エタノールを加えてＡＶＰを抽出し、遠心分離したのちに乾固させたものを測定試料とし、試料にアイソトープ標識したＡＶＰを加え、抗ＡＶＰ抗体と反応させることで、試料中に含まれるアイソトープ標識ＡＶＰと血漿由来ＡＶＰの競合阻害反応により血漿中ＡＶＰ濃度を測定する方法である（非特許文献１）。しかしながら、非特許文献１記載のＲＩＡは、ＡＶＰの抽出工程から測定終了まで合計で約３日を要する測定法であり、測定の簡便化及び迅速化が望まれてきた。
【０００５】
また、近年ではＡＶＰによるＶ２受容体の活性化に伴う細胞内環状アデノシン一リン酸濃度の測定をＡＶＰ濃度の測定に応用した例も知られている。具体的には、チャイニーズハムスター卵巣（ＣＨＯ）細胞を被験試料存在下でインキュベートし、試料中に含まれるＡＶＰがヒトＶ２Ｒを刺激することにより産生されるｃＡＭＰの量を、カルシウムイオンを介した発光によって検出するバイオアッセイ系を利用したＡＶＰの測定法が知られている（特許文献１）。
【０００６】
さらに最近では、Ｖ２Ｒのアミノ酸残基置換が検討されており、非特許文献２には、Ｆ２２９Ｖ、及びＲ１３７Ｃ／Ｌ変異体について報告されている。
【先行技術文献】
【特許文献】
【０００７】
再表２０１２－０８６７５６号公報
【非特許文献】
【０００８】
ＡＶＰキット「ヤマサ」添付文書, 2021年6月改訂（第4版）, https://www.info.pmda.go.jp/downfiles/ivd/PDF/800075_22700AMX00611000_A_04_03.pdf
Scientific Reports (2020) 10:9111
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００９】
本発明者らは、ＡＶＰ濃度の測定法の検討を行う中で、Ｖ２受容体を発現させた培養細胞を用いた測定系について検討し、測定系の感度は用いる受容体に大きく依存することを見出した。血液試料中のＡＶＰ濃度は０．１～数ｐｇ／ｍＬであり、非常に低濃度であるため、精度よく測定するためには高感度の測定系であることが望ましい。また、中枢性尿崩症の治療薬として用いられているＤＤＡＶＰ（１－ｄｅａｍｉｎｏ－８－Ｄ－ａｒｇｉｎｉｎｅ－ｖａｓｏｐｒｅｓｓｉｎ）は、Ｖ２受容体を活性化することで、試料中ＡＶＰ濃度の測定を妨げるため、患者血液試料中のＡＶＰ濃度の測定に際しては、ＤＤＡＶＰの影響を排除できることが望ましい。
【課題を解決するための手段】
【００１０】
本発明者らは、種々の哺乳類に由来するＶ２受容体を用いた検討から、Ｖ２受容体を発現させた培養細胞を用いる測定系では、測定系の感度は用いるＶ２受容体に依存することを見出し、様々な動物に由来するＶ２受容体を比較検討することで、高感度な受容体を見出した。また、新たに見出した高感度な受容体のうち、最も高感度であったカモノハシＶ２受容体のアミノ酸配列に点変異を導入することにより、ＤＤＡＶＰによる受容体の活性化を低減させ、本発明を完成させた。本発明は以下を提供する。
（【００１１】以降は省略されています）

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