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公開番号2025106825
公報種別公開特許公報(A)
公開日2025-07-17
出願番号2024000388
出願日2024-01-05
発明の名称画像観察機能付き分光装置
出願人ピンポイントフォトニクス株式会社
代理人個人
主分類G02B 21/00 20060101AFI20250710BHJP(光学)
要約【課題】
光学顕微鏡を用いてラマン顕微鏡観察を行うためには、光学顕微鏡が複数のフィルターターレットを有している必要があるため、通常の蛍光顕微鏡においてはラマン顕微鏡観察を行うことが容易でなく、特別な顕微鏡を用いなければならなかった。
【解決手段】
光学顕微鏡に一般に1つあるいは複数個具備されているカメラポートに接続が可能なラマン散乱光の分光計測が可能な画像観察機能付き分光装置を提供する。
【選択図】図7
特許請求の範囲【請求項１】
画像観察光学系への脱着が可能であり、
散乱光を励起するレーザ光源と、
試料からの散乱光の波長情報を取得する分光器と、
画像情報を取得する撮像素子とを有する画像観察機能付き分光装置であって、
画像観察光学系により観察を行う試料の画像の第１の結像位置に撮像素子を配置し、
画像観察光学系への脱着部と撮像素子との間に、レーザ光源の波長およびレーザ光源の波長よりも長い波長の光を反射する第１の分光ミラーを配置し、
第1の分光ミラーを配置することにより形成される第２の結像位置に、レーザ散乱光を励起するレーザ光が集光し、かつ、画像観察光学系を介して試料上にレーザ光が照射するように第１の光学レンズを配置し、
試料からの散乱光が、画像観察光学系と第１の分光ミラーを介して第２の結像位置に集光した後、第１の光学レンズによりほぼ平行光とされた後、分光器に入射するようにレーザ光を反射し散乱光を分離する第２の分光ミラーを配置することにより、
観察を行う試料の画像情報と分光情報を取得することを特徴とする画像観察機能付き分光装置
続きを表示（約 1,200 文字）【請求項２】
上記画像観察機能付き分光装置において、
画像観察光学系を用いて取得した試料の画像情報に、試料の分光情報を取得したレーザ照射位置を付加した情報を出力することを特徴とする請求項１に記載の画像観察機能付き分光装置
【請求項３】
上記画像観察機能付き分光装置において、
画像観察光学系を用いて取得した試料の画像情報を用いて、分光情報を取得する位置を指定することを特徴とする請求項１あるいは２に記載の画像観察機能付き分光装置
【請求項４】
上記画像観察機能付き分光装置において、
画像観察光学系を用いて取得した試料の画像情報は、画像観察機能付き分光装置内に配置される撮像素子とは異なる画像観察光学系に接続された撮像素子により撮影された画像情報であることを特徴とする請求項１より３のいずれかに記載の画像観察機能付き分光装置
【請求項５】
上記画像観察機能付き分光装置において、
第１の光学レンズと第２の分光ミラーとの間に角度が調整可能なミラーデバイスを配置することにより、画像観察光学系を介して試料上に照射されるレーザ光の位置を調整することを特徴とする請求項１より４のいずれかに記載の画像観察機能付き分光装置
【請求項６】
上記画像観察機能付き分光装置において、
画像観察光学系を用いて取得した試料の画像情報を用いて分光情報を取得する領域を指定することにより、対応する領域内の複数の位置の分光情報を取得することを特徴とする請求項１より５のいずれかに記載の画像観察機能付き分光装置
【請求項７】
上記画像観察機能付き分光装置において、
第１の分光ミラーは、厚さが約２ｍｍ以下の板状部材であり、レーザ光源の波長よりも長い波長の光を反射するコーティング面はレーザ光源側に配置されることを特徴とする請求項１より６のいずれかに記載の画像観察機能付き分光装置
【請求項８】
上記画像観察機能付き分光装置において、
第１の分光ミラーは、厚さが約１ｍｍの板状部材であり、レーザ光源の波長よりも長い波長の光を反射するコーティング面はレーザ光源側に配置されることを特徴とする請求項１より６のいずれかに記載の画像観察機能付き分光装置
【請求項９】
上記画像観察機能付き分光装置において、
画像観察機能付き分光装置が接続される画像観察光学系は、光学顕微鏡であることを特徴とすることを特徴とする請求項１より８のいずれかに記載の画像観察機能付き分光装置
【請求項１０】
上記画像観察機能付き分光装置において、
画像観察機能付き分光装置が接続される画像観察光学系の画像観察光学系への脱着部は、Ｃマウントであることを特徴とする請求項１より９のいずれかに記載の画像観察機能付き分光装置

発明の詳細な説明【技術分野】
【０００１】
ラマン分光法は、ラベルフリーで非破壊的に、化学的特性を得ることができる手法である。そして、顕微鏡の対物レンズを用いて、局所的に励起を行うレーザ光を照射することにより、試料の化学的特性を非破壊的に対物レンズの光学分解能に相当する空間分解能で評価できる手法である。
したがって創薬の領域においては、治療対象部位をラマン分光法を用いて投薬時から経時的に観察することにより、投与された薬がいつ対象部位に届き、どのような化学変化をするのかを観察することが可能である。
続きを表示（約 3,500 文字）【０００２】
図１にバイオ研究の領域において一般的に用いられている蛍光顕微鏡の概略構造図を示す。蛍光顕微鏡システム２０は、集光レンズ２により、水銀ランプなどのランプ光源１より出射した照明光束８がフィルターターレット１５内の蛍光フィルターキューブ１１を介して対物レンズ３に導かれ、例えば培養容器１６内に細胞培養液１８とともに配置されている細胞試料１９を照明する。蛍光フィルターキューブ１１内には蛍光試薬の照明に適した波長を選択するためにエキサイトフィルター１２が配置されているとともに、蛍光試薬より発光した蛍光波長が観察されるようにエミッションフィルター１４が配置されるとともに、照明光を対物レンズ３側に反射し、蛍光波長をカメラ６側に透過させるような反射・透過波長特性を有するダイクロイックミラー１３が配置されている。蛍光顕微鏡システム２０には、複数の蛍光フィルターキューブから観察に適しているフィルターキューブを容易に選択できるよう、複数の蛍光フィルターキューブを搭載するフィルターターレット１５が具備されている。
【０００３】
蛍光顕微鏡システム２０には結像レンズ４およびカメラ６が配置されており、対物レンズ３の観察倍率に応じた観察対象である細胞試料が蛍光発光する画像情報を取得することができる。蛍光顕微鏡システム２０は、観察者の各種ニーズに応じたカメラが取り付けられるようにカメラポート５が配置されている。図１に示した蛍光顕微鏡システム２０においては、カバーガラス１７を介して観察された顕微鏡の観察光９は、蛍光フィルターキューブ１１のダイクロイックミラー１３およびエミッションフィルター１４により所定の波長成分の観察光束９となり、結像レンズ４により収束され、ミラー１０により反射された後、カメラポート５に接続されているカメラ６内の撮像素子７に結像する。そして、観察者の各種ニーズに応じたカメラが光学顕微鏡に取り付けることができるように、Ｃマウントと呼ばれる規格のカメラポートがほぼすべての光学顕微鏡に１つあるいは複数個具備されている。Ｃマウント規格とは、内径２５．４ｍｍ（１インチ）でピッチ０．７９４ｍｍのネジが接続部に形成されており、ネジ端面から１７．５２６ｍｍの距離に結像位置が配置される規格である。
【０００４】
図２に、特許文献１に示すラマン分光法を用いた顕微観察方法を行うことが可能な光学系の構築例としてのラマン顕微鏡システム４０の構成例を示す。ラマン分光法においては、試料より散乱発光される光の波長が、照明光の波長からどの程度波数が変化したかどうかの情報からその物質情報を取得する方法である。そのためラマン顕微鏡システムは、試料に照射する光源にはなるべく波長幅が狭いレーザ光源を用いることが有効であり、試料より散乱発光される光の波長情報を取得するために分光器を用いる。さらに試料に照射する光を対物レンズを介して集光するとともに、図２に示したシステムにおいては集光する位置を２次元でスキャンするためのスキャン機構を有している。
光源にレーザ光源を用いること、分光器を用いて信号光の受光を行うこと、スキャン機構を有していることが図１に示した蛍光顕微鏡システム２０と異なっている。
【０００５】
ラマン顕微鏡システムにおいても、蛍光顕微鏡の画像観察機能により試料の画像情報を取得し、蛍光顕微鏡観察画像とラマン顕微鏡システムにより取得された情報とを比較を行うことは便利であるため、市販されているラマン顕微鏡観察装置には、図３に示すように、ラマン分光情報を取得する際には使用しない、ランプ光源１およびカメラ６が配置されていることが一般的となっている。図３に示す構成においては、フィルターターレット２７においてフィルターキューブが配置されていない位置とするとともに、フィルターターレット１５においてフィルターキューブ１１が配置される位置としている。
【０００６】
図２におけるラマン顕微鏡システム４０を用いて、培養容器１６内に細胞培養液１８とともに配置されている細胞試料１９のラマン分光情報を取得する方法を説明する。
例えば波長５３２ｎｍのレーザ光源２１より出射されたレーザ光は、集光レンズ２２により平行光をされ、ミラー３６により反射された後、レーザ光源の波長を反射し、レーザ光源２１の波長よりも長い波長を透過するダイクロイックミラー２３により反射した後、２次元可動ミラーデバイス２４に照射される。２次元可動ミラーデバイス２４におけるミラー２４ａにより反射したレーザ光は、ｆシータレンズよりなるスキャンレンズ２５に入射し、結像面３７に集光スポットを形成する。ミラー２４ａをスキャンレンズ２５のバックフォーカス位置に配置することにより、結像面３７に形成される集光スポットの位置は、可動ミラー２４ａの角度に応じて制御することができる。集光面３７に集光スポットを形成したレーザ光束３４は、結像レンズ２６および対物レンズ３により形成される結像光学系により、カバーガラス１７を介して観察を行う試料に集光される。ここで、ラマン顕微鏡システム４０においては、蛍光顕微鏡観察機能を具備するために、結像レンズ２６と対物レンズ３との間に、光学系からの退避が可能なミラー２９を第２のフィルターターレット２７内に配置されているフィルターキューブ２８に配置している。
【０００７】
試料より発光された散乱光束３５は、対物レンズ３により集光され、ミラー２９および結像レンズ２６により結像面３７に集光された後、スキャンレンズ２５によりほぼ平行光となった後、可動ミラー２４ａにより反射しダイクロイックミラー２３に至る。ダイクロイックミラー２３は、上述のようにレーザ光源２１の波長よりも長い波長を透過する波長特性を有しているため、レーザ光源２１の波長よりも長い波長成分の散乱光はダイクロイックミラー２３を透過しレーザ光源２１の光を吸収しレーザ光源２１の波長よりも長い波長を透過するレーザ光吸収フィルター３０を透過した後、集光レンズ３１によりマルチモード光ファイバー３２に入射された後、分光器３３に入射され散乱光の波長成分情報が計測され、ラマン分光情報が取得され、試料の化学的特性を取得することができる。
【０００８】
次に、ラマン顕微鏡システム４０を用いて、培養容器１６内に細胞培養液１８とともに配置されている細胞試料１９の蛍光観察像を取得する方法を図３を用いて説明する。蛍光顕微鏡観察の照明には、ランプ光源１より出射した照明光束８が第１のフィルターターレット１５内に具備されている蛍光フィルターキューブ１１内のエキサイトフィルター１２を透過しダイクロイックミラー１３により反射し対物レンズ３に入射する必要がある。
細胞試料１９の蛍光光束９は、結像レンズ４を介してカメラ６に入射するため、蛍光顕微鏡観察時においては、第２のフィルターターレット２７内に具備されているフィルターキューブ２８は退避される必要がある。
【０００９】
第１のフィルターターレット１５内に具備されている蛍光フィルターキューブ１１および、第２のフィルターターレット２７内に具備されているフィルターキューブ２８は、ともに、退避可能である必要がある。また、第１のフィルターターレット１５は、ランプ光源１の光路に接続され、第２のフィルターターレット２７は、レーザ光源２１の光路に接続されているため、第２のフィルターターレット２７と第１のフィルターターレット１５は、ともに、対物レンズ３の光軸上に配置されている必要はあるが、兼用は困難である。蛍光顕微鏡に具備されているフィルターターレットの数は通常１つであるため、通常顕微鏡にラマン顕微鏡機能を加えることは容易ではなく、フィルターターレットを２段構成にするという改造を行わなければならない。
【００１０】
さらに、図２および図３に示したラマン顕微鏡システム４０において、カメラ６により取得される画像と、可動ミラー２４の駆動により照射されるレーザ集光スポットとの位置情報を関係を得るためには、ラマン顕微鏡システム４０を構築した後に、試料のラマン分光情報と、カメラ６による画像撮影を行いデータを比較し、位置校正を行う必要があるため、カメラの交換作業を行った場合には、その都度試料のラマン分光情報と、カメラ６による画像撮影の位置校正作業を行う必要がある。
【先行技術文献】
【特許文献】
（【００１１】以降は省略されています）

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