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公開番号2025118414
公報種別公開特許公報(A)
公開日2025-08-13
出願番号2024013725
出願日2024-01-31
発明の名称二重鎖核酸に対してインベージョンして核酸配列特異的に結合可能な人工核酸プローブ、及び該人工核酸プローブを使用して二重鎖核酸中の核酸配列へ配列特異的に人工核酸プローブを結合する方法
出願人国立大学法人北陸先端科学技術大学院大学
代理人弁理士法人綾船国際特許事務所,個人
主分類C12N 15/10 20060101AFI20250805BHJP(生化学;ビール;酒精;ぶどう酒;酢;微生物学;酵素学;突然変異または遺伝子工学)
要約【課題】二重鎖核酸に対してインベージョンして核酸配列特異的に結合可能な人工核酸プローブであって、核酸配列の設計の自由度のより大きな人工核酸プローブを提供すること、及び該人工核酸プローブを使用して二重鎖核酸中の核酸配列へ配列特異的に人工核酸プローブを結合する方法を提供する。
【解決手段】配列中に光応答性人工ヌクレオシドを含む1本鎖核酸を、二重鎖核酸とともに保持した後に光照射する工程、を含む方法によって、配列中に光応答性人工ヌクレオシドを含む1本鎖核酸を、二重鎖核酸へインベージョンさせて、二重鎖核酸中の1本の鎖の相補的配列部分へと結合させて、配列中に光応答性人工ヌクレオシドを含む1本鎖核酸と二重鎖核酸との複合体を、製造する方法。
【選択図】図2A
特許請求の範囲【請求項１】
配列中に光応答性人工ヌクレオシドを含む１本鎖核酸を、二重鎖核酸とともに保持した後に光照射する工程、を含む方法によって、
配列中に光応答性人工ヌクレオシドを含む１本鎖核酸を、二重鎖核酸へインベージョンさせて、二重鎖核酸中の１本の鎖の相補的配列部分へと結合させて、配列中に光応答性人工ヌクレオシドを含む１本鎖核酸と二重鎖核酸との複合体を、製造する方法。
続きを表示（約 2,000 文字）【請求項２】
光応答性人工ヌクレオシドが、ヌクレオシドの塩基部分として、次の式Ｉで表される光応答性人工塩基を有する、請求項１に記載の方法：
TIFF
2025118414000015.tif
64
170
（ただし、式Ｉにおいて、
Ｒａは、シアノ基、アミド基、カルボキシル基、Ｃ２～Ｃ７のアルコキシカルボニル基、又は水素であり、
Ｒ１及びＲ２は、それぞれ独立に、シアノ基、アミド基、カルボキシル基、Ｃ２～Ｃ７のアルコキシカルボニル基、又は水素であり、
Ｎ－は、Ｎの一価基を表す）。
【請求項３】
配列中に光応答性人工ヌクレオシドを含む１本鎖核酸と二重鎖核酸との複合体において、
配列中に光応答性人工ヌクレオシドを含む１本鎖核酸が、二重鎖核酸中の１本の鎖の相補的配列部分と相補的塩基対を形成し、
光応答性人工ヌクレオシドが、ヌクレオシドの塩基部分として備えている光応答性人工塩基によって、二重鎖核酸中の１本の鎖の相補的配列部分中の、光応答性人工塩基と光架橋可能な塩基と、光架橋を形成して結合している、請求項１に記載の方法。
【請求項４】
二重鎖核酸中の１本の鎖の相補的配列部分中の、光応答性人工塩基と光架橋可能な塩基が、光応答性人工塩基の５’末端側に隣接する塩基と相補的な位置にある、請求項３に記載の方法。
【請求項５】
配列中に光応答性人工ヌクレオシドを含む１本鎖核酸が、
次の式ＩＩ：
（式ＩＩ）
TIFF
2025118414000016.tif
108
170
（ただし、式ＩＩにおいて、
Ｒａは、シアノ基、アミド基、カルボキシル基、Ｃ２～Ｃ７のアルコキシカルボニル基、又は水素であり、
Ｒ１及びＲ２は、それぞれ独立に、シアノ基、アミド基、カルボキシル基、Ｃ２～Ｃ７のアルコキシカルボニル基、又は水素である）
で表されるリボヌクレオチド、又は次の式ＩＩＩ：
（式ＩＩＩ）
TIFF
2025118414000017.tif
99
170
（ただし、式ＩＩＩにおいて、
Ｒａは、シアノ基、アミド基、カルボキシル基、Ｃ２～Ｃ７のアルコキシカルボニル基、又は水素であり、
Ｒ１及びＲ２は、それぞれ独立に、シアノ基、アミド基、カルボキシル基、Ｃ２～Ｃ７のアルコキシカルボニル基、又は水素である）
で表されるデオキシリボヌクレオチドが、リン酸ジエステル結合によって、オリゴヌクレオチドの塩基配列中に導入された、次の式ＩＶ：
（式ＩＶ）
TIFF
2025118414000018.tif
96
170
（ただし、式ＩＶにおいて、
Ｒａは、シアノ基、アミド基、カルボキシル基、Ｃ２～Ｃ７のアルコキシカルボニル基、又は水素であり、
Ｒ１及びＲ２は、それぞれ独立に、シアノ基、アミド基、カルボキシル基、Ｃ２～Ｃ７のアルコキシカルボニル基、又は水素であり、
Ｒｂは、式Ｉの基が塩基部分として導入されたリボヌクレオチドまたはデオキシリボヌクレオチドが、リン酸ジエステル結合によって塩基配列中に導入されたオリゴヌクレオチドの鎖のうちの、式Ｉの基が結合している五炭糖の基、及び五炭糖の基がリン酸ジエステル結合によって導入されているオリゴヌクレオチドの鎖を表す）
で表される核酸である、請求項２に記載の方法。
【請求項６】
光照射が、３６０～４００ｎｍの範囲にある波長を含む光の光照射である、請求項１に記載の方法。
【請求項７】
光照射が、０．０１～９０秒間の範囲にある照射時間の光照射である、請求項１に記載の方法。
【請求項８】
配列中に光応答性人工ヌクレオシドを含む１本鎖核酸を、二重鎖核酸とともに保持した後に光照射する工程において、
保持が、４～４０℃の範囲にある温度で、１０分～１２０分の保持時間での保持である、請求項１に記載の方法。
【請求項９】
配列中に光応答性人工ヌクレオシドを含む１本鎖核酸を、二重鎖核酸とともに保持した後に光照射する工程において、
保持が、ｐＨ５～８の範囲にある溶液中での保持である、請求項１に記載の方法。
【請求項１０】
配列中に光応答性人工ヌクレオシドを含む１本鎖核酸からなる、二重鎖核酸インベージョン結合用１本鎖人工核酸プローブであって、
光応答性人工ヌクレオシドが、請求項２の式Ｉで表される光応答性人工塩基をヌクレオシドの塩基部分として有する光応答性人工ヌクレオシドである、二重鎖核酸インベージョン結合用１本鎖人工核酸プローブ。
（【請求項１１】以降は省略されています）
発明の詳細な説明【技術分野】
【０００１】
本発明は、二重鎖核酸に対してインベージョンして核酸配列特異的に結合可能な人工核酸プローブ、及び該人工核酸プローブを使用して二重鎖核酸中の核酸配列へ配列特異的に人工核酸プローブを結合する方法に関する。
続きを表示（約 1,500 文字）【背景技術】
【０００２】
分子生物学の分野の基本的な技術に、核酸配列を特異的に認識する人工核酸プローブの技術がある。この人工核酸プローブ技術は、核酸配列を特異的に認識することを可能にすることから、多くの応用がある。
【０００３】
そのために、人工核酸プローブ技術は、分子生物学の基礎研究だけではなく、例えば、医療分野における診断や治療、あるいは治療薬や診断薬等の開発や製造、工業及び農業分野における酵素や微生物等の開発や製造に使用される極めて重要な技術である。特に、最近では、テーラーメイド治療への期待が高まるにしたがって、より簡易に遺伝子診断を行うための技術として注目されている。
【０００４】
このような人工核酸プローブ技術による核酸配列の特異的な認識において、一本鎖の形態となった核酸ではなく、二重鎖の形態のままの核酸に対して、その核酸配列を特異的に認識することができる技術、すなわち、二重鎖核酸へインベージョンして相補的な塩基対を形成可能な人工核酸プローブの技術については、アンチジーン法、Ｇｅｎｏｍｉｃｉｎｓｉｔｕｈｙｂｒｉｄｉｚａｔｉｏｎ（ＧＩＳＨ）への応用が期待されることから、特に重要な技術である。
【０００５】
非特許文献１は、このような二重鎖核酸へのインベージョンを実現する手段として、３－ｃｙａｎｏｖｉｎｙｌｃａｒｂａｚｏｌｅと５－ｃｙａｎｏｕｒａｃｉｌとを同一分子内に備えた２本の人工核酸からなるセットを開示している。非特許文献１によれば、この人工核酸のセットは互いに特定の配列構造を備えるようにして、２本の人工核酸のそれぞれが、核酸二重鎖のそれぞれの鎖と相補対を形成することで、プローブ同士での自己会合を防ぎつつ、優れたインベージョン能力を発揮するように設計されている。このような２本の人工核酸の組み合わせによるセットが、二重鎖核酸へのインベージョンが可能なプローブとして機能することを、非特許文献１は開示している。
【０００６】
特許文献１は、光応答性人工ヌクレオチドである
CNV
Ｋ及びその製造方法を開示している。
【先行技術文献】
【特許文献】
【０００７】
国際公開ＷＯ２００９／０６６４４７号
【０００８】
ＳｈｉｇｅｔａｋａＮａｋａｍｕｒａ，ＨａｙａｔｏＫａｗａｂａｔａａｎｄＫｅｎｚｏＦｕｊｉｍｏｔｏ，Ｃｈｅｍ．Ｃｏｍｍｕｎ．，２０１７，５３，ｐｐ７６１６－７６１９
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００９】
安定したＤＮＡ二重鎖に対して、ＤＮＡプローブがインベージョンして、そのＤＮＡ二重鎖のそれぞれの鎖に対して新たに相補対を形成するのは、熱力学的な観点から、本来であれば、非常に難しい。このような熱力学的な観点から、ＤＮＡ二重鎖のそれぞれの鎖に対して少しでも多くの相補対を形成して、少しでも熱力学的に安定となるように、このようなＤＮＡプローブは、二本鎖のセットとして設計されることが通常である。
【００１０】
非特許文献１に開示されたプローブも、このような技術常識に沿って、２本の人工核酸のセットからなるプローブとして設計されており、２本の人工核酸のそれぞれがＤＮＡ二重鎖のそれぞれの鎖と相補対を形成することで、少しでも熱力学的に安定となるように工夫されている。
（【００１１】以降は省略されています）

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