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公開番号2025118593
公報種別公開特許公報(A)
公開日2025-08-13
出願番号2025051586,2021533505
出願日2025-03-26,2019-12-12
発明の名称MERFISHおよび他の適用のための増幅法およびシステム
出願人プレジデントアンドフェローズオブハーバードカレッジ
代理人個人,個人,個人
主分類C12Q 1/6844 20180101AFI20250805BHJP(生化学;ビール;酒精;ぶどう酒;酢;微生物学;酵素学;突然変異または遺伝子工学)
要約【課題】細胞内または他の試料中の核酸をイメージングするか、または決定するための方法を提供する。
【解決手段】試料を、核酸プローブへと曝露すること;核酸プローブを、核酸プローブに結合することが可能な一次増幅核酸へと曝露すること;蛍光を使用して、試料中の核酸プローブの分布を決定すること;および試料中の蛍光分布に基づき、符合語を創出することを含む方法。
【選択図】図1-2
特許請求の範囲【請求項１】
試料を、核酸プローブへと曝露すること；
核酸プローブを、核酸プローブに結合することが可能な一次増幅核酸へと曝露することであって、最大数の一次増幅核酸が、核酸プローブに結合することが可能なこと；
一次増幅核酸を、一次増幅核酸に結合することが可能な一次増幅核酸へと曝露することであって、最大数の二次増幅核酸が、一次増幅核酸に結合することが可能なこと；
蛍光を使用して、試料中の核酸プローブの分布を決定すること；
試料中の蛍光分布に基づき、符合語を創出すること；および
符合語のうちの少なくとも一部について、符合語を、正当な符合語へとマッチさせることであって、マッチが見出されない場合、適宜、エラー補正を符合語へと適用して、正当な符合語を形成すること
を含む方法。
続きを表示（約 660 文字）【請求項２】
試料を、少なくとも５個の異なる核酸プローブへと曝露することを含む、請求項１に記載の方法。
【請求項３】
試料を、少なくとも１０個の異なる核酸プローブへと曝露することを含む、請求項１または２に記載の方法。
【請求項４】
試料を、少なくとも１００個の異なる核酸プローブへと曝露することを含む、請求項１から３のいずれか一項に記載の方法。
【請求項５】
試料を、複数個の核酸プローブへと、逐次的に曝露することを含む、請求項１から４のいずれか一項に記載の方法。
【請求項６】
複数個の核酸プローブが、異なる配列を伴う核酸プローブのコンビナトリアルの組合せを含む、請求項１から５のいずれか一項に記載の方法。
【請求項７】
核酸プローブの、コンビナトリアルの組合せが、試料中のＲＮＡ分子種のコンビナトリアルの組合せをターゲティングする、請求項６に記載の方法。
【請求項８】
核酸プローブの、コンビナトリアルの組合せが、試料中のＤＮＡ配列のコンビナトリアルの組合せをターゲティングする、請求項６または７に記載の方法。
【請求項９】
複数個の核酸プローブのうちの少なくとも一部が、ＤＮＡを含む、請求項１から８のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１０】
複数個の核酸プローブのうちの少なくとも一部が、ＲＮＡを含む、請求項１から９のいずれか一項に記載の方法。
（【請求項１１】以降は省略されています）
発明の詳細な説明【技術分野】
【０００１】
関連出願
本出願は、参照によりその全体において本明細書に組み込まれる、Ｚｈｕａｎｇらによる、２０１８年１２月１３日に出願され、「ＡｍｐｌｉｆｉｃａｔｉｏｎＭｅｔｈｏｄｓａｎｄＳｙｓｔｅｍｓｆｏｒＭＥＲＦＩＳＨａｎｄＯｔｈｅｒＡｐｐｌｉｃａｔｉｏｎｓ」と題された、米国特許仮出願第６２／７７９，３３３号の利益を主張する。
続きを表示（約 3,100 文字）【０００２】
政府による資金供与
本発明は、米国国立保健研究所により与えられる、第ＭＨ１１３０９４号、第ＭＨ１１１５０２号、および第ＭＨ１１４８３０号の下にある政府助成によりなされた。米国連邦政府は、本発明において、一定の権利を有する。
【０００３】
分野
本発明は、全般的に、細胞内または他の試料中の核酸をイメージングするか、または決定するためのシステムおよび方法に関する。
【背景技術】
【０００４】
単一分子蛍光インサイチューハイブリダイゼーション（ｓｍＦＩＳＨ）は、単一細胞内の、個々のＲＮＡ分子の直接的な検出により、ＲＮＡの存在度および空間的位置の両方を提示する。この技法を使用することにより、ＲＮＡの局在は、身体のパターン化の発生、細胞分裂時における、細胞運命の決定、局所的翻訳、細胞の遊走、および極性の確立など、複数の細胞機能と関連することが示されている。無傷の細胞内および組織内の、トランスクリプトームスケールにおけるＲＮＡの局在について研究するために、ＭＥＲＦＩＳＨ（ｍｕｌｔｉｐｌｅｘｅｄｅｒｒｏｒ－ｒｏｂｕｓｔｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｃｅｉｎｓｉｔｕｈｙｂｒｉｄｉｚａｔｉｏｎ）、およびインサイチューシーケンシングが開発されている。これらの中において、ＭＥＲＦＩＳＨは、エラーに対してロバストな、二進法のバーコード化および逐次的イメージングを使用して、ｓｍＦＩＳＨ測定を、高検出効率を伴って、マルチプレックス化する。しかし、シグナルの光子カウントが大きくなれば、イメージングの収集速度、深部組織のイメージングにより引き起こされる光散乱、および試料の自己蛍光に起因する低シグナル対バックグラウンド比により制限されているスループットを改善するであろう。したがって、光子カウント増大の改善が、イメージングスループットの実質的な増大、バックグラウンドのシグナルレベルを上回るシグナルをもたらすのに十分なプローブの結合を可能としない場合がある短鎖ＲＮＡのターゲティングを可能とし、かつ／またはマルチプレックス測定を、高レベルのバックグラウンドシグナルを伴う種類の試料へと拡張するのに必要とされている。
【０００５】
しかし、マルチプレックス化単一分子ＲＮＡイメージング法の性能は、シグナルの増幅により低下する場合も難題がもたらされる場合もある多くの特性に依存する。例えば、分子間のシグナル輝度のばらつきは、比較的小さいことが重要であることが多い。同様に、シグナルの物理的サイズ、または個々の分子からの拡がりが、可能な限り小さいことも、物理的に隣接する分子からのシグナルの、実質的な重複を防止するのに重要であることが多い。これと平行して、増幅法は、高効率でない場合があり、一部の分子が増幅されない一方、他の分子は増幅される場合もあり、検出分子の割合の低減をもたらす。加えて、複数の、直交的な分子シグナルを増幅することが可能なことも重要であることが多く、増幅法を、より顕著に異なる分子シグナルへと、迅速に拡張することが可能なことは、極めて重要である。最後に、このような増幅法は、試料調製時間を短縮するように、迅速であるべきである。これらの理由により、シグナル輝度のばらつきを導入せず、シグナルの、個々の分子からの物理的拡がりを増大させない増幅法であって、全ての標的分子からのシグナル増幅において、高度に効率的であり、複数の顕著に異なる標的へと、迅速に拡張されうる増幅法が、必要とされている。
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００６】
本発明は、全般的に、細胞内または他の試料中の核酸をイメージングするか、または決定するための、システムおよび方法に関する。本発明の対象物は、場合によって、相互に関連した製品、特定の問題に対する代替的な解決法、および／または１つもしくは複数のシステムおよび／もしくは品目の、複数の異なる使用を伴う。
【課題を解決するための手段】
【０００７】
一態様において、本発明は、全般的に、方法を対象とする。実施形態の第１のセットに従い、方法は、試料を、核酸プローブ（ｎｕｃｌｅｉｃａｃｉｄｐｒｏｂｅ）へと曝露すること、核酸プローブを、核酸プローブに結合することが可能な一次増幅核酸（ｐｒｉｍａｒｙａｍｐｌｉｆｉｅｒｎｕｃｌｅｉｃａｃｉｄ）へと曝露することであって、最大数の一次増幅核酸が、核酸プローブに結合することが可能なこと、一次増幅核酸を、一次増幅核酸に結合することが可能な一次増幅核酸（ｓｅｃｏｎｄａｒｙａｍｐｌｉｆｉｅｒｎｕｃｌｅｉｃａｃｉｄ）へと曝露することであって、最大数の二次増幅核酸が、一次増幅核酸に結合することが可能なこと、蛍光を使用して、試料中の核酸プローブの分布を決定すること、試料中の蛍光分布に基づき、符号語（ｃｏｄｅｗｏｒｄ）を創出すること、および符号語のうちの少なくとも一部について、符号語を、正当な符号語へとマッチさせることであって、マッチが見出されない場合、適宜、エラー補正を符号語へと適用して、正当な符号語を形成することを含む。
【０００８】
実施形態の別のセットにおける方法は、試料を、核酸プローブへと曝露すること、核酸プローブを、核酸プローブに結合することが可能な一次増幅核酸へと曝露すること、一次増幅核酸を、一次増幅核酸に結合することが可能な二次増幅核酸へと曝露することであって、一次増幅核酸および二次増幅核酸の、標的への結合が、可飽和であること、蛍光を使用して、試料中の核酸プローブの分布を決定すること、試料中の蛍光分布に基づき、符号語を創出すること、および符号語のうちの少なくとも一部について、符号語を、正当な符号語へとマッチさせることであって、マッチが見出されない場合、適宜、エラー補正を符号語へと適用して、正当な符号語を形成することを含む。
【０００９】
実施形態のさらに別のセットにおいて、方法は、試料を、核酸プローブへと曝露すること、核酸プローブを、核酸プローブに結合することが可能な一次増幅核酸へと曝露すること、一次増幅核酸を、一次増幅核酸に結合することが可能な二次増幅核酸へと曝露することであって、二次増幅核酸が、固定距離以内の一次増幅核酸に結合すること、蛍光を使用して、試料中の核酸プローブの分布を決定すること、試料中の蛍光分布に基づき、符号語を創出すること、および符号語のうちの少なくとも一部について、符号語を、正当な符号語へとマッチさせることであって、マッチが見出されない場合、適宜、エラー補正を符号語へと適用して、正当な符号語を形成することを含む。
【００１０】
実施形態のなおも別のセットに従う方法は、試料を、核酸プローブへと曝露すること、核酸プローブを、核酸プローブに結合することが可能な一次増幅核酸へと曝露することであって、一次増幅核酸が、４つの天然に存在するヌクレオチドのうちの３つだけから形成されること、一次増幅核酸を、一次増幅核酸に結合することが可能な二次増幅核酸へと曝露すること、蛍光を使用して、試料中の核酸プローブの分布を決定すること、試料中の蛍光分布に基づき、符号語を創出すること、および符号語のうちの少なくとも一部について、符号語を、正当な符号語へとマッチさせることであって、マッチが見出されない場合、適宜、エラー補正を符号語へと適用して、正当な符号語を形成することを含む。
（【００１１】以降は省略されています）

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