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公開番号2025155417
公報種別公開特許公報(A)
公開日2025-10-14
出願番号2024059240
出願日2024-04-01
発明の名称結核菌群検出用オリゴヌクレオチド及びその用途
出願人東洋紡株式会社,国立大学法人筑波大学
代理人弁理士法人三枝国際特許事務所
主分類C12Q 1/689 20180101AFI20251006BHJP(生化学;ビール;酒精;ぶどう酒;酢;微生物学;酵素学;突然変異または遺伝子工学)
要約【課題】結核菌群を特異的に検出できるプローブを提供すること。
【解決手段】特定の塩基配列の(A)79～130番目若しくは(B)277～312番目、又は特定の塩基配列の(C)37～84番目の塩基配列或いはそれらに対して相補的な塩基配列において連続する15塩基以上24塩基以下の塩基配列を含むか、或いは該塩基配列と1～3個の塩基の相違を有する塩基配列を含むオリゴヌクレオチドであって、5’末端及び3’末端の少なくとも一方の末端塩基がシトシンであり、5’末端及び3’末端の一方の末端塩基のシトシンが蛍光色素で標識されているオリゴヌクレオチドを有する、結核菌群検出用プローブが開示される。
【選択図】なし
特許請求の範囲【請求項１】
下記のオリゴヌクレオチド（Ａ）～（Ｃ）のいずれかを有する結核菌群検出用プローブ：
（Ａ）配列番号５７で示される塩基配列の７９～１３０番目の塩基配列又はそれに対して相補的な塩基配列において連続する１５塩基以上２４塩基以下の塩基配列を含むか、或いは該塩基配列と１～３個の塩基の相違を有する塩基配列を含むオリゴヌクレオチドであって、５’末端及び３’末端の少なくとも一方の末端塩基がシトシンであり、５’末端及び３’末端の一方の末端塩基のシトシンが蛍光色素で標識されているオリゴヌクレオチド；
（Ｂ）配列番号５７で示される塩基配列の２７７～３１２番目の塩基配列又はそれに対して相補的な塩基配列において連続する１５塩基以上２４塩基以下の塩基配列を含むか、或いは該塩基配列と１～３個の塩基の相違を有する塩基配列を含むオリゴヌクレオチドであって、５’末端及び３’末端の少なくとも一方の末端塩基がシトシンであり、５’末端及び３’末端の一方の末端塩基のシトシンが蛍光色素で標識されているオリゴヌクレオチド；
（Ｃ）配列番号５８で示される塩基配列の３７～８４番目の塩基配列又はそれに対して相補的な塩基配列において連続する１５塩基以上２４塩基以下の塩基配列を含むか、或いは該塩基配列と１～３個の塩基の相違を有する塩基配列を含むオリゴヌクレオチドであって、５’末端及び３’末端の少なくとも一方の末端塩基がシトシンであり、５’末端及び３’末端の一方の末端塩基のシトシンが蛍光色素で標識されているオリゴヌクレオチド。
続きを表示（約 1,100 文字）【請求項２】
前記オリゴヌクレオチド（Ａ）～（Ｃ）の長さが１９～２４塩基である、請求項１に記載の結核菌群検出用プローブ。
【請求項３】
前記オリゴヌクレオチド（Ａ）～（Ｃ）の長さが１５～１９塩基である、請求項１に記載の結核菌群検出用プローブ。
【請求項４】
前記オリゴヌクレオチド（Ａ）が配列番号２３～２８のいずれかで示される塩基配列又はそれに対して相補的な塩基配列を含み；
前記オリゴヌクレオチド（Ｂ）が配列番号２９～３１のいずれかで示される塩基配列又はそれに対して相補的な塩基配列を含み；
前記オリゴヌクレオチド（Ｃ）が配列番号４８～５６のいずれかで示される塩基配列を含む、請求項１に記載の結核菌群検出用プローブ。
【請求項５】
前記蛍光色素が、グアニンとの相互作用により消光する蛍光消光色素である、請求項１に記載の結核菌群検出用プローブ。
【請求項６】
前記蛍光色素が、フルオレセイン及びその誘導体、ローダミン及びその誘導体、並びにＢＯＤＩＰＹ及びその誘導体からなる群より選択される少なくとも１つの蛍光消光色素である、請求項１に記載の結核菌群検出用プローブ。
【請求項７】
前記蛍光色素が、４，４－ジフルオロ－５，７－ジメチル－４－ボラ－３ａ，４ａ－ジアザ－ｓ－インダセン－３－プロピオン酸（ＢＯＤＩＰＹ－ＦＬ）、カルボキシローダミン６Ｇ，ＴＡＭＲＡ，ローダミン６Ｇ，テトラブロモスルホンフルオレセイン（ＴＢＳＦ）、及び２－オキソ－６，８－ジフルオロ－７－ジヒドロキシ－２Ｈ－１－ベンゾピラン－３－カルボン酸（ＰａｃｉｆｉｃＢｌｕｅ）からなる群より選択される少なくとも１つの蛍光消光色素である、請求項１に記載の結核菌群検出用プローブ。
【請求項８】
請求項１に記載のオリゴヌクレオチド（Ａ）～（Ｃ）を有する結核菌群検出用プローブから選択される少なくとも２種を含む、結核菌群検出用プローブセット。
【請求項９】
前記オリゴヌクレオチド（Ａ）を有する結核菌群検出用プローブ及び前記オリゴヌクレオチド（Ｂ）の特徴を有する結核菌群検出用プローブから選択される少なくとも１種と、前記オリゴヌクレオチド（Ｃ）を有する結核菌群検出用プローブから選択される少なくとも１種とを含む、請求項８に記載の結核菌群検出用プローブセット。
【請求項１０】
前記オリゴヌクレオチド（Ｂ）を有する結核菌群検出用プローブから選択される少なくとも１種と、前記オリゴヌクレオチド（Ｃ）を有する結核菌群検出用プローブから選択される少なくとも１種とを含む、請求項９に記載の結核菌群検出用プローブセット。
（【請求項１１】以降は省略されています）
発明の詳細な説明【技術分野】
【０００１】
本発明は、結核菌群を特異的に検出するためのプローブ、及び当該プローブを使用する検出方法、試薬、キット等に関する。
続きを表示（約 1,600 文字）【背景技術】
【０００２】
結核は結核菌（Mycobacterium tuberculosis（ＭＴＢ））を始めとする結核菌群（ＭＴＢｃｏｍｐｌｅｘ）によって引き起こされる感染症である。結核が発症した人は主に呼吸器症状を呈する。さらに、結核患者が咳やくしゃみなどによって空気中に結核菌群を排出すると、結核菌群は空気を介して他の人へと感染する。結核菌群は感染力が強いため、結核菌感染者を迅速かつ正確に検査することは、公衆衛生上、非常に重要である。
【０００３】
結核菌群の検査方法としては古くから培養同定法が用いられてきた他、最近では核酸増幅法による検査も行われている。核酸増幅法としてはＰＣＲ法やリアルタイムＰＣＲ法、ＴＲＣ法などが主に用いられている（特許文献１、非特許文献１、特許文献２）。核酸増幅法のターゲットとなる核酸についてはリボソームＲＮＡ遺伝子やｒｐｏＢ遺伝子などが挙げられる。また、結核菌群特有のマルチコピー領域であるＩＳ６１１０領域は、研究室や医療施設でのインハウス検査で広く利用されてきたターゲットの一つである（非特許文献２）。
【０００４】
結核菌群のゲノムＤＮＡにおいて、ＩＳ６１１０は最大で２０コピー前後存在すると言われている。一方で、結核菌群の中にはＩＳ６１１０を欠損した株も存在している。また、ＩＳ６１１０領域の配列には一塩基多型が存在しており、株によって塩基が異なり得る箇所がある。そのため、ＩＳ６１１０をターゲットとして結核菌群を検出する従来の方法では、ＩＳ６１１０欠損株やこの領域に一塩基多型を有する株を検出できない場合がある。
【０００５】
また従来知られているＩＳ６１１０領域をターゲットとする検出方法では、ＴａｑＭａｎプローブ又は分子ビーコンプローブ等のダブル標識核酸プローブ（加水分解プローブなどとも呼ばれる）を用いたリアルタイムＰＣＲが主に実施されている（非特許文献１、２）。本方法では、コントロールＲＮＡを基準にウイルス量を定量することが可能であるが、ＰＣＲのサイクル毎に測光する必要があるため、最も短い場合でも検出に約１時間を要することが多い。
【０００６】
核酸増幅産物を検出する別の方法としては、融解曲線解析法が知られている。融解曲線解析法は、核酸増幅と検出を別工程で実施することができ、最短３０分間程度で比較的簡便に測定が可能である。さらに蛍光標識核酸プローブを用いた融解曲線解析は、自動分析装置を利用した遺伝子検査にも適合させ易いという利点がある。
【先行技術文献】
【特許文献】
【０００７】
特許第４９０５１３０号公報
特許第６１４２５２４号公報
【非特許文献】
【０００８】
B.M.Melissa et al., Journal of Clinical Microbiology, 2011, 49, p.3458-3462
HY.Wang et al., Scientific Reports, 2019, 14;9(1).113
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００９】
本発明は、結核菌群を特異的に検出する更なる有用な方法等を提供することを目的とする。
【課題を解決するための手段】
【００１０】
本発明者らは、上記課題に鑑み鋭意検討した結果、特定の塩基配列からなるオリゴヌクレオチドを所定の方法で蛍光標識したプローブを用いることによって、結核菌群を特異的に検出可能であることを見出した。また更に検討を重ね、当該プローブを２種以上組み合わせて使用することにより、より特異性高く結核菌群を正確に検出できることを見出した。本発明者らは、上記の知見を基に更に検討を重ねることにより、本発明を完成させた。
（【００１１】以降は省略されています）

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