特許ウォッチ

公開番号2025157431
公報種別公開特許公報(A)
公開日2025-10-15
出願番号2025120770,2021564063
出願日2025-07-17,2020-12-11
発明の名称細胞外プリン受容体リガンドを検出するシステムおよび当該システムを導入した非ヒト動物
出願人中外製薬株式会社
代理人個人,個人,個人,個人
主分類A01K 67/0278 20240101AFI20251007BHJP(農業;林業;畜産;狩猟;捕獲;漁業)
要約【課題】低侵襲的かつ経時的、全身的に細胞外プリン受容体リガンドを検出することが可能な評価系を提供する。
【解決手段】細胞外に存在するプリン受容体リガンドを検出するための第1の融合タンパク質および第2の融合タンパク質を発現する遺伝子改変非ヒト動物であって、前記第1の融合タンパク質がプリン受容体リガンドと結合する膜タンパク質と第1のレポータータンパク質を含み、前記第2の融合タンパク質が前記リガンドの結合した前記膜タンパク質と結合するタンパク質と第2のレポータータンパク質を含む、遺伝子改変非ヒト動物、ならびのその細胞を提供する。
【選択図】なし
特許請求の範囲【請求項１】
細胞外に存在するプリン受容体リガンドを検出するための第１の融合タンパク質および第２の融合タンパク質を発現する遺伝子改変非ヒト動物であって、
前記第１の融合タンパク質がプリン受容体リガンドと結合する膜タンパク質と第１のレポータータンパク質を含み、
前記第２の融合タンパク質が前記リガンドの結合した前記膜タンパク質と結合するタンパク質と第２のレポータータンパク質を含む、遺伝子改変非ヒト動物。
続きを表示（約 630 文字）【請求項２】
第１のレポータータンパク質と第２のレポータータンパク質が、スプリットレポータータンパク質の各サブユニットである、請求項１に記載の遺伝子改変非ヒト動物。
【請求項３】
前記スプリットレポータータンパク質がスプリットルシフェラーゼである、請求項２に記載の遺伝子改変非ヒト動物。
【請求項４】
前記膜タンパク質がＧタンパク質共役受容体（ＧＰＣＲ）またはその部分である、請求項１～３のいずれか一項に記載の遺伝子改変非ヒト動物。
【請求項５】
前記ＧＰＣＲがＰ２受容体である、請求項４に記載の遺伝子改変非ヒト動物。
【請求項６】
前記Ｐ２受容体がＰ２Ｙ受容体である、請求項５に記載の遺伝子改変非ヒト動物。
【請求項７】
前記Ｐ２Ｙ受容体がＰ２Ｙ１１である、請求項６に記載の遺伝子改変非ヒト動物。
【請求項８】
前記プリン受容体リガンドがＰ２受容体リガンドである、請求項５～７のいずれか一項に記載の遺伝子改変非ヒト動物。
【請求項９】
前記Ｐ２受容体リガンドがＡＭＰ、ＡＤＰ、ＡＴＰ、ＵＴＰ、ＵＤＰ、ＵＤＰグルコースからなる群から選択される、請求項８に記載の遺伝子改変非ヒト動物。
【請求項１０】
前記Ｐ２受容体リガンドがＡＴＰである、請求項８又は９に記載の遺伝子改変非ヒト動物。
（【請求項１１】以降は省略されています）
発明の詳細な説明【技術分野】
【０００１】
本発明は、プリン受容体リガンドをリガンドとする受容体タンパク質のシグナル伝達を利用した細胞外プリン受容体リガンドを検出するシステム、および当該システムを導入した遺伝子改変非ヒト動物に関する。また細胞外プリン受容体リガンドを検出するシステムを導入した遺伝子改変非ヒト動物を用いた疾患の病態のモニタリングおよび化合物の評価方法等に関する。
続きを表示（約 3,300 文字）【背景技術】
【０００２】
プリン受容体（ｐｕｒｉｎｅｒｇｉｃｒｅｃｅｐｔｏｒ）はアデノシンならびにＡＴＰなどヌクレオチド類をリガンドとする一群の細胞表面受容体である。プリン受容体は免疫異常をはじめ様々な疾患と関与していることが報告されており、プリン受容体を標的とするプリン受容体阻害薬やプリン受容体作動薬などの開発も進められている。プリン受容体リガンドとして、ＡＴＰやアデノシンをはじめそれらの代謝産物を含むヌクレオチドが知られており、これらのプリン受容体リガンドとプリン受容体によるシグナル伝達経路は神経伝達、筋肉収縮、痛覚、味覚、炎症反応など、多様な生理現象にかかわることが報告されている。
【０００３】
ＡＴＰやアデノシンをはじめとするプリン受容体リガンドは生体におけるシグナル伝達物質として機能することから生体内における産生や分解などの挙動の検証や濃度測定等が試みられている。その一例として、細胞死に伴い細胞内の大量のＡＴＰが細胞外に漏出することが知られており、炎症過程における重要な危険信号としての役割を果たしていることが報告されている。また癌組織においても癌細胞が細胞死すると細胞内の大量のＡＴＰが細胞外に漏出するため、癌組織におけるＡＴＰ濃度は正常組織と比べて高いことが報告されている（非特許文献１，３，４）。
【０００４】
生体中の細胞外プリン受容体リガンドを含む生体内物質を測定する手法として、Ｍｉｃｒｏｄｉａｌｙｓｉｓ法が挙げられる。この手法は、組織から回収した組織液あるいは細胞外液を、ＨＰＬＣ等を用いて分析する。測定対象がＡＴＰである場合は、ＨＰＬＣ等による分析手法以外にもルシフェリン－ルシフェラーゼアッセイにより測定する手法も利用することができる。しかしながら、上記の手法を用いた場合であっても、検出・測定されたプリン受容体リガンドが細胞内由来なのか、細胞外由来なのかを明確に区別することは困難であり、またリアルタイムに生体内のプリン受容体リガンド濃度を測定することはできない。さらに、Ｍｉｃｒｏｄｉａｌｙｓｉｓ法においては、組織へ針を挿入して組織液を回収するが、この際に刺入部位の細胞死や組織の壊死が起こることある。そのような場合には、測定手技によるアーティファクトが測定結果に影響する課題がある。測定物質がＡＴＰの場合には、細胞死や細胞の炎症反応に伴い分泌されることが知られており、本手法による測定にはより適さない。特許文献２には、ＡＴＰ合成酵素のεサブユニットのアミノ末端側およびカルボキシ末端側に、蛍光共鳴エネルギー移動におけるドナー及びアクセプターとなりうる２種類の蛍光タンパク質をそれぞれ結合させてなる融合タンパク質を発現する非ヒト哺乳動物を用いて、生体内のＡＴＰ分布と変動を観察する手法が報告されている。しかしながら、本手法では細胞内のＡＴＰに焦点を当てており、細胞外ＡＴＰを評価することはできない。
【０００５】
また、生体における細胞外ＡＴＰを測定する試みとして、ルシフェラーゼを細胞外に発現させた遺伝子改変細胞を用いる手法が報告されている（非特許文献１，２、特許文献１）。前記手法では、前記遺伝子改変細胞が、細胞外ＡＴＰ濃度が高い環境下に曝された場合にルシフェリン－ルシフェラーゼ反応によりシグナルを発光し、このシグナルを検出することによって生体における細胞外ＡＴＰを測定する手法である。しかしながら、本手法においては、当該細胞を生体内に移入する必要があるが、生体内に移入された細胞を全身にくまなく分布させることは困難であり、ＡＴＰがいつ細胞外に放出されるかが不明な場合には、当該細胞をいつ移入させれば良いかの判断が困難であるといった課題が残されている。また、移入した細胞が宿主免疫系により排除されてしまう場合には使用できないという課題もある。さらに、上記のルシフェリン－ルシフェラーゼ反応では、測定できるのはＡＴＰのみであり、その他のプリン受容体リガンドを測定することはできない。
【０００６】
ＡＴＰに限らずプリン受容体リガンドは細胞外のシグナル伝達物質として種々の疾患との関連が報告されているものの、どのような疾患で、どのようなタイミングで、どのような細胞外プリン受容体リガンドが、どのように機能するかという点に関しては不明な点が多い。そのため、生体および病態における細胞外プリン受容体リガンドの機能を評価するために、低侵襲的かつ経時的、全身的に細胞外プリン受容体リガンドを検出することが可能な評価系が必要であるが、そのような評価系は未だ存在していなかった。
【先行技術文献】
【特許文献】
【０００７】
ＷＯ２００６／１２６２３１
ＷＯ２０１５／１０８１０２
【非特許文献】
【０００８】
Ｐａｔｒｉｚｉａｅｔ．ａｌ．（２００８）ＰＬｏＳＯｎｅ．３，ｅ２５９９
ＦｒａｎｃｅｓｃｏＤｉＶｉｒｇｉｌｉｏｅｔ．ａｌ．（２０１６）ＭｅｔｈｏｄｓＭｏｌＢｉｏｌ．１４１７，１１５－２９
ＩｄｚｋｏＭｅｔ．ａｌ．（２００７）ＮａｔＭｅｄ．Ａｕｇ；１３（８）：９１３－９
ＬｏｍｍａｔｚｓｃｈＭｅｔ．ａｌ．（２０１０）ＡｍＪＲｅｓｐｉｒＣｒｉｔＣａｒｅＭｅｄ．Ｍａｙ１；１８１（９）：９２８－３４
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００９】
本発明は上記のような状況に鑑みてなされたものであり、低侵襲的かつ経時的、全身的に細胞外プリン受容体リガンドを検出することが可能な評価系を提供することを目的とする。より具体的には、本発明は、細胞外プリン受容体リガンドを検出・評価するためのレポータータンパク質を全身的に発現する遺伝子改変非ヒト動物を提供すること、また細胞外プリン受容体リガンドを検出する評価システムを構築することを目的とする。さらに、本発明は、前記遺伝子改変非ヒト動物およびレポータータンパク質を用いた細胞外プリン受容体リガンドを検出する評価システムを用いて、種々の疾患の検出や種々の疾患の病態のモニタリング、およびそれらの疾患の治療薬のスクリーニング方法を提供することを目的とする。
【課題を解決するための手段】
【００１０】
本発明者らは、上記課題を解決すべく鋭意検討を重ねた結果、プリン受容体であるＰ２Ｙ受容体（Ｐ２Ｙｐｕｒｉｎｅｒｇｉｃｒｅｃｅｐｔｏｒ）と細胞内でそれに結合するβアレスチン（β－Ａｒｅｓｔｉｎ）にスプリットルシフェラーゼ（ＳｐｌｉｔＬｕｃｉｆｅｒａｓｅ）の各サブユニットタンパク質をそれぞれ融合し、それらを全身で発現する遺伝子改変マウスを作製し、細胞外ＡＴＰを検出できることを見出した。すなわち、本遺伝子改変によれば、細胞外ＡＴＰがＰ２Ｙ受容体と結合すると、細胞内でＰ２Ｙ受容体とβアレスチンが結合してそれぞれに融合されたサブユニットタンパク質が適切に会合してルシフェラーゼが再構築・生成される。ルシフェラーゼは適切な基質の存在下にて発光シグナルを発現することができ、このシグナルを検出することによって細胞外ＡＴＰを検出することができる。また、前記遺伝子改変マウスより単離した細胞を用いてＡＴＰの測定を行うと、検出される発光シグナル強度は濃度依存的で定量的にＡＴＰ濃度を測定できることが確認された。これにより、ｉｎｖｉｔｒｏでのＡＴＰ濃度測定やスクリーニングなどへも応用が可能である。さらには、本遺伝子改変マウスの生体における細胞外ＡＴＰの検出を検討したところ、その発光シグナルは濃度依存的に検出することができ、非侵襲的に全身の細胞外ＡＴＰを経時的に検出することができることを見出した。
（【００１１】以降は省略されています）

関連特許