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公開番号2025060891
公報種別公開特許公報(A)
公開日2025-04-10
出願番号2024230245,2023519611
出願日2024-12-26,2021-09-28
発明の名称糸状ファージを産生するための細菌線毛タンパク質複合体FimGt-DsF安定化タンパク質複合体
出願人エフ. ホフマン-ラロシュアーゲー,F. HOFFMANN-LA ROCHE AKTIENGESELLSCHAFT
代理人個人,個人,個人
主分類C40B 40/10 20060101AFI20250403BHJP(コンビナトリアル技術)
要約【課題】ファージミド又は糸状ファージを産生するための改善された安定化タンパク質複合体、並びにこれらの産生及び使用のための方法を提供する。
【解決手段】ファージミド又は糸状ファージを産生するための細菌線毛タンパク質複合体FimGt-DsF安定化タンパク質複合体は、FimGtへの結合に必要な細菌のDsFポリペプチド及びDsFへの結合に必要な細菌FimGtポリペプチド又はその細菌ホモログを含む。
【選択図】図1-A
特許請求の範囲【請求項１】
タンパク質複合体であって、
ａ）Ｎ末端からＣ末端方向に一般式（Ｉ）を有する第１のポリペプチド鎖
Ｘ－ＤｓＦ－Ｙ－ＰＯＩ（Ｉ）、
及び
ｂ）Ｎ末端からＣ末端方向に一般式（ＩＩ）を有する第２のポリペプチド鎖
Ｘ－ＦｉｍＧｔ－Ｙ－ＣＰＦ（ＩＩ）
を含み、
式中、
Ｘは、存在しないか、又は細菌のリーダー配列若しくは転座配列を示し、
ＤｓＦは、ＦｉｍＧｔへの結合に必要な細菌ＤｓＦポリペプチド又はその細菌ホモログを示し、
Ｙは、存在しないか、又はリンカー配列、検出可能なペプチド配列及び／若しくは前記ポリペプチド鎖を精製するためのペプチド配列の少なくとも１つを示し、
ＰＯＩは目的のタンパク質を示し、
ＦｉｍＧｔは、ＤｓＦへの結合に必要な細菌ＦｉｍＧｔポリペプチド又はその細菌ホモログを示し、
ＣＰＦは、糸状ファージのコートタンパク質を示す、タンパク質複合体。
続きを表示（約 1,700 文字）【請求項２】
タンパク質複合体であって、
ａ）Ｎ末端からＣ末端方向に一般式（ＩＩＩ）を有する第１のポリペプチド鎖
Ｘ－ＳＵＢ－ＤｓＦ－Ｙ（ＩＩＩ）、
及び
ｂ）少なくとも１つのＰＯＩを含み、Ｎ末端からＣ末端方向に一般式（ＩＶ）を有する第２のポリペプチド鎖
Ｘ－ＦｉｍＧｔ（ＰＯＩ）－Ｙ（ＰＯＩ）－ＣＰＦ（ＩＶ）
を含み、
式中、
Ｘは、存在しないか、又は細菌のリーダー配列若しくは転座配列を示し、
ＤｓＦは、ＦｉｍＧｔへの結合に必要な細菌ＤｓＦポリペプチド又はその細菌ホモログを示し、
Ｙ（ＰＯＩ）は、存在しないか、又はＰＯＩが結合した分岐リンカー配列、検出可能なペプチド配列及び／又は前記ポリペプチド鎖を精製するためのペプチド配列の少なくとも１つを示し、
ＰＯＩは目的のタンパク質を示し、
ＦｉｍＧｔ（ＰＯＩ）は、任意にＰＯＩが連結された、ＤｓＦへの結合に必要な細菌ＦｉｍＧｔポリペプチド又はその細菌ホモログを示し、
ＳＵＢは基質を示し、
ＣＰＦは、糸状ファージのコートタンパク質を示す、タンパク質複合体。
【請求項３】
前記細菌のリーダー配列又は転座配列が、分泌経路による分泌のためのリーダー配列又は転座系による転座のための転座配列、例えばＰｅｌＢ、ＤｓｂＡ、ＴｏｒＡ、及びＰｈｏＡ、並びに一般的な分泌（Ｓｅｃ）経路、双生児アルギニン転座（Ｔａｔ）経路、Ｔ２ＳＳ経路、Ｔ３ＳＳ経路、Ｔ５ＳＳ経路、及びＳｅｃＡ２経路から選択される、請求項１又は２に記載のタンパク質複合体。
【請求項４】
前記細菌のＤｓＦポリペプチド及びＦｉｍＧｔポリペプチドが、大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）に由来するか、又はグラム陰性細菌、特に腸内細菌科（Ｅｎｔｅｒｏｂａｃｔｅｒｉａｃｅａｅ）に由来するＤｓＦ及び／又はＦｉｍＧｔのホモログから選択される、請求項１
～３のいずれか一項に記載のタンパク質複合体。
【請求項５】
Ｙが、分岐若しくは非分岐のペプチドリンカー配列、例えば分岐若しくは非分岐のグリシン若しくはグリシン／セリンペプチドリンカー配列、検出可能なペプチド配列としてのｍｙｃタグ及びＴｉｅ２タグ、並びに／又は前記ポリペプチド鎖を精製するためのカルモジュリン結合ペプチド、Ｈｉｓタグ若しくはマルトースタンパク質結合配列から選択される、請求項１～４のいずれか一項に記載のタンパク質複合体。
【請求項６】
前記複合体が、それぞれ式Ｉ及びＩＩ並びに式ＩＩＩ及びＩＶの独立した隣接ポリペプチド配列間のドナー鎖相補性によって安定化又は本質的に安定化される、請求項１～５のいずれか一項に記載のタンパク質複合体。
【請求項７】
ＣＰＦが、ファージｆｄ、Ｍ１３、ｆ１、及びＰｆ１のマイナーコートタンパク質、例えばｐＩＩＩ、ｐＶＩ、ｐＶＩＩ、ｐＶＩＩＩ、ｐＩＸ、及び糸状ファージのそれぞれのコートタンパク質を機能的に置換することができるそれらの切断型から選択される、請求項１～６のいずれか一項に記載のタンパク質複合体。
【請求項８】
ＰＯＩが、酵素、抗体、及び核酸ポリメラーゼ、並びにそれらの機能的断片、並びにそれらのライブラリーからなる群から選択される、請求項１～７のいずれか一項に記載のタンパク質複合体。
【請求項９】
ＳＵＢが、酵素の基質、切断可能な検出可能マーカー、抗原マーカー及びそれらのライブラリーからなる群から選択される、請求項１～８のいずれか一項に記載のタンパク質複合体。
【請求項１０】
請求項１～９のいずれか一項に記載のタンパク質複合体を含む、少なくとも１つの目的のタンパク質（ＰＯＩ）を提示する糸状ファージであって、好ましくは、ｆｄ、Ｍ１３、ｆ１、及びＰｆ１、又は前記糸状ファージのライブラリーから選択され、任意にＰＯＩ及び／又は基質（ＳＵＢ）のバリアントを提示する、糸状ファージ。
（【請求項１１】以降は省略されています）
発明の詳細な説明【技術分野】
【０００１】
本発明は、ファージミド又は糸状ファージを産生するための細菌線毛タンパク質複合体ＦｉｍＧｔ－ＤｓＦ安定化タンパク質複合体、及びこれらの使用方法に関する。
続きを表示（約 2,000 文字）【背景技術】
【０００２】
発明の背景
ファージディスプレイは、改善された結合剤を選択するための強力な方法である。ファージディスプレイ研究は、他のファージと比較してＭ１３との作業が比較的容易であるため、大腸菌に感染する糸状ファージＭ１３の使用を伴うことが多い。Ｍ１３のような糸状ファージは、宿主細胞を溶解せず、代わりに分泌によって放出される。これにより、潜在的に干渉する細胞質タンパク質からのファージ粒子のより簡単でより効率的な精製が可能になる。Ｍ１３上の目的のポリペプチド（ＰＯＩ）の表示は、最も一般的には、マイナーコートタンパク質ｐＩＩＩのＮ末端への融合によって達成されるが、他のコートタンパク質（ｐＶＩ、ｐＶＩＩ、ｐＶＩＩＩ及びｐＩＸ）への融合も使用されている。
【０００３】
ファージディスプレイは、抗体ライブラリー及びペプチドライブラリーの成功した選択のために広く利用されている。しかしながら、従来のファージディスプレイは、その広範な使用を妨げるいくつかの制限を示す。１つの欠点は、相互作用のために遊離Ｃ末端を必要とするタンパク質のディスプレイ、ｃＤＮＡライブラリーのディスプレイ、及びＣ末端融合に耐性でないタンパク質など、Ｃ末端ディスプレイに適していない用途のための堅牢なＮ末端ディスプレイ（ＰＯＩのＮ末端の付着によるディスプレイとして定義される）の欠如である。
【０００４】
国際公開第２０１８／０４１７４０号は、第１の結合部分に融合した目的のタンパク質（ＰＯＩ）を含む、細胞の表面上のタンパク質の固定化に使用するための非共有結合ディスプレイシステムを開示しており、第１の結合部分は、ＦｉｍＧＴ／ＤｓＦ相互作用対の１つのパートナーを含む。
【０００５】
国際公開第２０１２／０２８６９７号は、固定化及び／又は親和性精製手順で使用するためのタンパク質タグ及び親和性リガンドとしてＤｓタグ及びＤｓタグの同族リガンドを含むドナー鎖（Ｄｓ）相補性に基づくシステムを開示している。
【０００６】
Ｇｉｅｓｅｅｔａｌ．（「ＴｈｅＭｏｓｔＳｔａｂｌｅＰｒｏｔｅｉｎ－ＬｉｇａｎｄＣｏｍｐｌｅｘ：ＡｐｐｌｉｃａｔｉｏｎｓｆｏｒＯｎｅ－ＳｔｅｐＡｆｆｉｎｉｔｙＰｕｒｉｆｉｃａｔｉｏｎａｎｄＩｄｅｎｔｉｆｉｃａｔｉｏｎ
ｏｆＰｒｏｔｅｉｎＡｓｓｅｍｂｌｉｅｓ」、ＡＮＧＥＷＡＮＤＴＥＣＨＥＭＩＥＩＮＴＥＲＮＡＴＩＯＮＡＬＥＤＩＴＩＯＮ、ｖｏｌ．５１、ｎｏ．１８、２７Ａｐｒｉｌ２０１２、４４７４－４４７８頁）は、タンパク質アセンブリの一段階親和性精製及び同定のためのＦｉｍＧＴ／ＤｓＦシステムの使用を開示している。
【０００７】
ｐＩＩＩ、ｐＶＩ、ｐＶＩＩＩ及びｐＩＸのＣ末端へのタンパク質のＮ末端融合が示されているが、ディスプレイレベルは低く（Ｊｅｓｐｅｒｓｅｔａｌ．Ｂｉｏ／Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ１９９５，１３，３７８；Ｖｅｌａｐｐａｎｅｔａｌ．，ＮｕｃｌｅｉｃＡｃｉｄＲｅｓ．２０１０，３８，４，ｅ２２）、ペプチド又は小タンパク質でのみ成功又は首尾よく示され（Ｆｕｈｅｔａｌ．ＦＥＢＳＬｅｔｔｅｒｓ２０００，４８０，２３１；Ｆｕｈ，ＧｅｒｍａｉｎｅａｎｄＳｉｄｈｕ，Ｓａｃｈｄｅ
ｖＳ．（２０００），Ｅｆｆｉｃｉｅｎｔｐｈａｇｅｄｉｓｐｌａｙｏｆｐｏｌｙｐｅｐｔｉｄｅｓｆｕｓｅｄｔｏｔｈｅｃａｒｂｏｘｙ－ｔｅｒｍｉｎｕｓ
ｏｆｔｈｅＭ１３ｇｅｎｅ－３ｍｉｎｏｒｃｏａｔｐｒｏｔｅｉｎ，ＦＥＢＳＬｅｔｔｅｒｓ，４８０，ｄｏｉ：１０．１０１６／Ｓ００１４－５７９３（００）０１９４６－３；２５Ｖｅｌａｐｐａｎｅｔａｌ．ＮｕｃｌｅｉｃＡｃｉｄＲｅｓ．２０１０，３８，４，ｅ２２）、及び／又は必要とされる個別化最適化が必要であった（Ｈｅｌｄｅｔａｌ．，ＪＭｏｌＢｉｏｌ．２００４，３４０（３），５８７）。
【発明の概要】
【０００８】
したがって、本発明の目的は、ファージミド又は糸状ファージを産生するための改善された安定化タンパク質複合体、並びにこれらの産生及び使用のための方法を提供することである。
【０００９】
他の目的及び利点は、本発明の本明細書を検討する際に当業者に明らかになるであろう。
【００１０】
本発明の第１の態様では、上記目的は、以下を含むタンパク質複合体を提供することによって解決される。
（【００１１】以降は省略されています）

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