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公開番号2025071620
公報種別公開特許公報(A)
公開日2025-05-08
出願番号2023181946
出願日2023-10-23
発明の名称遺伝子組換えコクナーゼおよびその前駆体
出願人学校法人近畿大学
代理人個人
主分類C12N 9/48 20060101AFI20250428BHJP(生化学;ビール;酒精;ぶどう酒;酢;微生物学;酵素学;突然変異または遺伝子工学)
要約【課題】従来生糸を精製して膠成分であるセリシンを除去し、絹糸を得るには、煮沸やアルカリ処理といった方法を用いていたが、これらの方法ではセリシンの除去は十分ではなく、また絹糸にダメージを与える場合もあった。蚕が分泌するコクナーゼはセリシン除去の好適な処理液と考えられるが、天然物は微量しか取れず、さらに、遺伝子組換え法による調製では、リフォールディング反応や酵素活性化反応のための自己プロセッシングで、非特異的切断がおこり、目的酵素の回収率が低かった。
【解決手段】配列番号3の遺伝子組換えプロコクナーゼから得られる遺伝子組換えコクナーゼでは、野生型と同様の酵素活性を有する上に、リフォールディング反応や酵素活性化反応のための自己プロセッシングで、不都合な切断が生じず、目的酵素を高い収率を得ることができる。
【選択図】なし
特許請求の範囲【請求項１】
配列番号３に記載されたアミノ酸配列においてＮ末端から８番目のＸがリシン（Ｋ）であり、６３番目、１３１番目、１３３番目のＸがアルギニン（Ｒ：Ａｒｇ）とリシン（Ｋ：Ｌｙｓ）以外のアミノ酸に置換された遺伝子組換えプロコクナーゼ。
続きを表示（約 320 文字）【請求項２】
前記Ｎ末端から８番目のＸがアルギニン（Ｒ：Ａｒｇ）とリシン（Ｋ：Ｌｙｓ）以外のアミノ酸に置換された請求項１に記載された遺伝子組換えプロコクナーゼ。
【請求項３】
請求項１に記載された遺伝子組換えプロコクナーゼから得られる遺伝子組換えコクナーゼ。
【請求項４】
請求項２に記載された遺伝子組換えプロコクナーゼから得られる遺伝子組換えコクナーゼ。
【請求項５】
請求項１または２の何れかの請求項に記載された遺伝子組換えプロコクナーゼを有する生糸の洗浄液。
【請求項６】
請求項３または４の何れかの請求項に記載された遺伝子組換えコクナーゼを有する生糸の洗浄液。

発明の詳細な説明【技術分野】
【０００１】
本発明は自己分解反応を抑制した遺伝子組換えコクナーゼに関する。
続きを表示（約 5,800 文字）【背景技術】
【０００２】
絹糸は蚕から得られる伝統的な糸材であり、そのなめらかな手触りから高級感のある嗜好性の高い織物を提供することができる。通常絹糸は、以下の様にして得られる。蚕の作った繭を煮繭（しゃけん）し、これによって得られた繭の緒（いとぐち）を、必要とする糸の太さに応じて数本集めて捲き取り、「生糸（若しくは「製糸」）」とする。
【０００３】
この生糸は、通常、約７０％前後のフィブロインと３０％前後のセリシンよりなる。つまり、生糸は、フィブロインからなるフィラメントが膠質のセリシンで接着されている構造になっている。そこで、生糸を熱水や希アルカリで処理し、セリシンを除くことによって（精錬）、ほぼ純粋のフィブロインからなる糸材を得る。これが「絹糸」である。
【０００４】
精錬の工程をより具体的に説明すると、炭酸ナトリウム水溶液中で８５℃～９０℃で４０分間ほど加熱したり（特許文献１）、プロテアーゼのような加水分解酵素と超音波振動を用いて精錬する（特許文献２）等が知られている。
【先行技術文献】
【特許文献】
【０００５】
特開２０００－１９９１２１号公報
特開昭５３－１３０３９７号公報
【非特許文献】
【０００６】
Ｆｅｌｓｔｅｄ，Ｒ．Ｌ．；Ｋｒａｍｅｒ，Ｋ．Ｊ．；Ｌａｗ，Ｊ．Ｈ．；Ｂｅｒｇｅｒ，Ｅ．；Ｋａｆａｔｏｓ，Ｆ．Ｃ．Ｃｏｃｏｏｎａｓｅ．ＩＶ．ＭｅｃｈａｎｉｓｍｏｆａｃｔｉｖａｔｉｏｎｏｆｐｒｏｃｏｃｏｏｎａｓｅｆｒｏｍＡｎｔｈｅｒａｅａｐｏｌｙｐｈｅｍｕｓ．Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．１９７３，２４８，３０１２－３０２０．
Ｒｏｄｂｕｍｒｅｒ，Ｐ．；Ａｒｔｈａｎ，Ｄ．；Ｕｙｅｎ，Ｕ．；Ｙｕｖａｎｉｙａｍａ，Ｊ．；Ｓｖａｓｔｉ，Ｊ．；Ｗｏｎｇｓａｅｎｇｃｈａｎｔｒａ，Ｐ．Ｙ．ＦｕｎｃｔｉｏｎａｌｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎｏｆａＢｏｍｂｙｘｍｏｒｉｃｏｃｏｏｎａｓｅ：Ｐｏｔｅｎｔｉａｌａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎｆｏｒｓｉｌｋｄｅｇｕｍｍｉｎｇ．ＡｃｔａＢｉｏｃｈｉｍ．Ｂｉｏｐｈｙｓ．Ｓｉｎ．２０１２，４４，９７４－９８３．
Ｓａｋａｔａ，Ｎ．；Ｏｇａｔａ，Ａ．；Ｔａｋｅｇａｗａ，Ｍ．；Ｔａｊｉｍａ，Ｎ．；Ｎｉｓｈｉｍｕｒａ，Ｍ．；Ｈａｇｉｗａｒａ，Ｔ．；Ｍｉｙａｚａｗａ，Ｍ．；Ｓｈｉｍａｍｏｔｏ，Ｓ．；Ｈｉｄａｋａ，Ｙ．Ｔｈｅｐｒｏｐｅｐｔｉｄｅｓｅｑｕｅｎｃｅａｓｓｉｓｔｓｔｈｅｃｏｒｒｅｃｔｆｏｌｄｉｎｇｒｅｑｕｉｒｅｄｆｏｒｔｈｅｅｎｚｙｍａｔｉｃａｃｔｉｖｉｔｙｏｆｃｏｃｏｏｎａｓｅ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．Ｂｉｏｐｈｙｓ．Ｒｅｓ．Ｃｏｍｍｕｎ．２０２２，６２４，３５－３９．
Ｓｃｈｒｏｅｄｅｒ，Ｄ．Ｄ．；Ｓｈａｗ，Ｅ．Ｃｈｒｏｍａｔｏｇｒａｐｈｙｏｆｔｒｙｐｓｉｎａｎｄｉｔｓｄｅｒｉｖａｔｉｖｅｓ．Ｃｈａｒａｃｔｅｒｉｚａｔｉｏｎｏｆａｎｅｗａｃｔｉｖｅｆｏｒｍｏｆｂｏｖｉｎｅｔｒｙｐｓｉｎ．Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．１９６８，２４３，２９４３－２９４９．
Ａｈｓａｎ，Ｎ．；Ａｏｋｉ，Ｈ．；Ｗａｔａｂｅ，Ｓ．ＯｖｅｒｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎｉｎＥｓｃｈｅｒｉｃｈｉａｃｏｌｉａｎｄｆｕｎｃｔｉｏｎａｌｒｅｃｏｎｓｔｉｔｕｔｉｏｎｏｆａｎｃｈｏｖｙｔｒｙｐｓｉｎｏｇｅｎｆｒｏｍｔｈｅｂａｃｔｅｒｉａｌｉｎｃｌｕｓｉｏｎｂｏｄｙ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．２００５，３０，１９３－２０５．
Ｏｈｓｈｉｍａ，Ｙ．；Ｓｕｚｕｋｉ，Ｙ．；Ｎａｋａｔａｎｉ，Ａ．；Ｎｏｈａｒａ，Ｄ．Ｒｅｆｏｌｄｉｎｇｏｆｆｕｌｌｙｒｅｄｕｃｅｄｂｏｖｉｎｅｐａｎｃｒｅａｔｉｃｔｒｙｐｓｉｎ．Ｊ．Ｂｉｏｓｃｉ．Ｂｉｏｅｎｇ．２００８，１０６，３４５－３４９．
Ｓｉｎｈａ，Ｎ．Ｋ．；Ｌｉｇｈｔ，Ａ．Ｒｅｆｏｌｄｉｎｇｏｆｒｅｄｕｃｅｄ，ｄｅｎａｔｕｒｅｄｔｒｙｐｓｉｎｏｇｅｎａｎｄｔｒｙｐｓｉｎｉｍｍｏｂｉｌｉｚｅｄｏｎＡｇａｒｏｓｅｂｅａｄｓ．Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．１９７５，２５０，８６２４－８６２９．
Ｃｏｌｏｍｂ，Ｅ．；Ｇｕｙ，Ｏ．；Ｄｅｐｒｅｚ，Ｐ．；Ｍｉｃｈｅｌ，Ｒ．；Ｆｉｇａｒｅｌｌａ，Ｃ．Ｔｈｅｔｗｏｈｕｍａｎｔｒｙｐｓｉｎｏｇｅｎｓ：Ｃａｔａｌｙｔｉｃｐｒｏｐｅｒｔｉｅｓｏｆｔｈｅｃｏｒｒｅｓｐｏｎｄｉｎｇｔｒｙｐｓｉｎｓ．Ｂｉｏｃｈｉｍ．Ｂｉｏｐｈｙｓ．Ａｃｔａ１９７８，５２５，１８６－１９３．
Ｂｏｙｅｒ，Ｐ．Ｄ．；Ｋｒｅｂｓ，Ｅ．Ｇ．ＴｈｅＥｎｚｙｍｅｓ，３ｒｄｅｄ．；ＡｃａｄｅｍｉｃＰｒｅｓｓ：Ｃａｍｂｒｉｄｇｅ，ＭＡ，ＵＳＡ，１９７０；ｐ．２５０－２７７．
Ｌｉｎｇ，Ｚ．；Ｌｉｕ，Ｙ．；Ｔｅｎｇ，Ｓ．；Ｋａｎｇ，Ｚ．；Ｚｈａｎｇ，Ｊ．；Ｃｈｅｎ，Ｊ．；Ｄｕ，Ｇ．ＲａｔｉｏｎａｌｄｅｓｉｇｎｏｆａｎｏｖｅｌｐｒｏｐｅｐｔｉｄｅｆｏｒｉｍｐｒｏｖｉｎｇａｃｔｉｖｅｐｒｏｄｕｃｔｉｏｎｏｆＳｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓｇｒｉｓｅｕｓｔｒｙｐｓｉｎｉｎＰｉｃｈｉａｐａｓｔｏｒｉｓ．Ａｐｐｌ．Ｅｎｖｉｒｏｎ．Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．２０１３，７９，３８５１－３８５５．
Ｇｏｄｚｈａｅｖ，Ｎ．Ｍ．Ｓｔｕｄｙｏｆｔｒｙｐｓｉｎ－ｓｕｂｓｔｒａｔｅａｎｄｔｒｙｐｓｉｎ－ｉｎｈｉｂｉｔｏｒｃｏｍｐｌｅｘｅｓ．１．ＣｏｎｆｏｒｍａｔｉｏｎｏｆＡｓｐ－１０２，Ｈｉｓ－５７ａｎｄＳｅｒ－１９５ｒｅｓｉｄｕｅｓｉｎｔｈｅｔｒｙｐｓｉｎａｃｔｉｖｅｃｅｎｔｅｒ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．１９８４，１８，１４３２－１４３５．
Ｌｏｅｆｆｌｅｒ，Ｌ．Ｊ．；Ｐｉｅｒｃｅ，Ｊ．Ｖ．Ａｃｙｌａｚｉｄｅｄｅｒｉｖａｔｉｖｅｓｉｎａｆｆｉｎｉｔｙｃｈｒｏｍａｔｏｇｒａｐｈｙ．Ｉｍｍｏｂｉｌｉｚａｔｉｏｎｏｆｅｎｚｙｍａｔｉｃａｌｌｙａｃｔｉｖｅｔｒｙｐｓｉｎｏｎｂｅａｄｅｄａｇａｒｏｓｅａｎｄｐｏｒｏｕｓｇｌａｓｓ．Ｂｉｏｃｈｉｍ．Ｂｉｏｐｈｙｓ．Ａｃｔａ１９７３，３１７，２０－２７．
Ｐｈｏｅｕｒｋ，Ｃ．；Ｍｕｓｈｔａｑ，Ａ．Ｕ．；Ｒｏｇｎｅ，Ｐ．；Ｗｏｌｆ－Ｗａｔｚ，Ｍ．Ｍｉｌｌｉｇｒａｍｓｃａｌｅｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ，ｒｅｆｏｌｄｉｎｇ，ａｎｄｐｕｒｉｆｉｃａｔｉｏｎｏｆＢｏｍｂｙｘｍｏｒｉｃｏｃｏｏｎａｓｅｕｓｉｎｇａｒｅｃｏｍｂｉｎａｎｔＥ．ｃｏｌｉｓｙｓｔｅｍ．ＰｒｏｔｅｉｎＥｘｐ．Ｐｕｒｉｆ．２０２１，１８６，１０５９１９．
Ｊｕｍｐｅｒ，Ｊ．；Ｅｖａｎｓ，Ｒ．；Ｐｒｉｔｚｅｌ，Ａ．；Ｇｒｅｅｎ，Ｔ．；Ｆｉｇｕｒｎｏｖ，Ｍ．；Ｒｏｎｎｅｂｅｒｇｅｒ，Ｏ．；Ｔｕｎｙａｓｕｖｕｎａｋｏｏｌ，Ｋ．；Ｂａｔｅｓ，Ｒ．；Ｚｉｄｅｋ，Ａ．；Ｐｏｔａｐｅｎｋｏ，Ａ．；ｅｔａｌ．ＨｉｇｈｌｙａｃｃｕｒａｔｅｐｒｏｔｅｉｎｓｔｒｕｃｔｕｒｅｐｒｅｄｉｃｔｉｏｎｗｉｔｈＡｌｐｈａＦｏｌｄ．Ｎａｔｕｒｅ２０２１，５９６，５８３－５８９．
Ｈｉｄａｋａ，Ｙ．；Ｏｈｎｏ，Ｍ．；Ｈｅｍｍａｓｉ，Ｂ．；Ｈｉｌｌ，Ｏ．；Ｆｏｒｓｓｍａｎｎ，Ｗ．Ｇ．；Ｓｈｉｍｏｎｉｓｈｉ，Ｙ．Ｉｎｖｉｔｒｏｄｉｓｕｌｆｉｄｅ－ｃｏｕｐｌｅｄｆｏｌｄｉｎｇｏｆｇｕａｎｙｌｙｌｃｙｃｌａｓｅ－ａｃｔｉｖａｔｉｎｇｐｅｐｔｉｄｅａｎｄｉｔｓｐｒｅｃｕｒｓｏｒｐｒｏｔｅｉｎ．Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ１９９８，３７，８４９８－８５０７．
Ｈｉｄａｋａ，Ｙ．；Ｓｈｉｍｏｎｏ，Ｃ．；Ｏｈｎｏ，Ｍ．；Ｏｋｕｍｕｒａ，Ｎ．；Ａｄｅｒｍａｎｎ，Ｋ．；Ｆｏｒｓｓｍａｎｎ，Ｗ．Ｇ．；Ｓｈｉｍｏｎｉｓｈｉ，Ｙ．Ｄｕａｌｆｕｎｃｔｉｏｎｏｆｔｈｅｐｒｏｐｅｐｔｉｄｅｏｆｐｒｏｕｒｏｇｕａｎｙｌｉｎｉｎｔｈｅｆｏｌｄｉｎｇｏｆｔｈｅｍａｔｕｒｅｐｅｐｔｉｄｅ：Ｄｉｓｕｌｆｉｄｅ－ｃｏｕｐｌｅｄｆｏｌｄｉｎｇａｎｄｄｉｍｅｒｉｚａｔｉｏｎ．Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２０００，２７５，２５１５５－２５１６２．
Ｙａｓｕｍｉｔｓｕ，Ｈ．；Ｏｚｅｋｉ，Ｙ．；Ｋａｎａｌｙ，Ｒ．Ａ．ＲＡＭＡｃａｓｅｉｎｚｙｍｏｇｒａｐｈｙ：Ｔｉｍｅ－ｓａｖｉｎｇａｎｄｈｉｇｈｌｙｓｅｎｓｉｔｉｖｅｃａｓｅｉｎｚｙｍｏｇｒａｐｈｙｆｏｒＭＭＰ７ａｎｄｔｒｙｐｓｉｎ．Ｅｌｅｃｔｒｏｐｈｏｒｅｓｉｓ２０１６，３７，２９５９－２９６２．
Ｓｈｉｍａｍｏｔｏ，Ｓ．；Ｆｕｋｕｔｓｕｊｉ，Ｍ．；Ｏｓｕｍｉ，Ｔ．；Ｇｏｔｏ，Ｍ．；Ｔｏｙｏｄａ，Ｈ．；Ｈｉｄａｋａ，Ｙ．Ｔｏｐｏｌｏｇｉｃａｌｒｅｇｕｌａｔｉｏｎｏｆｔｈｅｂｉｏａｃｔｉｖｅｃｏｎｆｏｒｍａｔｉｏｎｏｆａｄｉｓｕｌｆｉｄｅ－ｒｉｃｈｐｅｐｔｉｄｅ，ｈｅａｔ－ｓｔａｂｌｅｅｎｔｅｒｏｔｏｘｉｎ．Ｍｏｌｅｃｕｌｅｓ２０２０，２５，４７９８．
Ｓａｋａｔａ，Ｎ．，ＡｙｕｍｉＯｇａｔａ，ＭａｉＴａｋｅｇａｗａ，ＹｕｒｉＭｕｒａｋａｍｉ，ＭｉｓａｋｉＮｉｓｈｉｍｕｒａ，ＭｉｔｓｕｈｉｒｏＭｉｙａｚａｗａ，ＴｅｒｕｋｉＨａｇｉｗａｒａ，ＳｈｉｇｅｒｕＳｈｉｍａｍｏｔｏ，ａｎｄＹｕｊｉＨｉｄａｋａ， “Ｄｅｇｒａｄａｔｉｏｎ－ＳｕｐｐｒｅｓｓｅｄＣｏｃｏｏｎａｓｅｆｏｒＩｎｖｅｓｔｉｇａｔｉｎｇｔｈｅＰｒｏｐｅｐｔｉｄｅ－ＭｅｄｉａｔｅｄＡｃｔｉｖａｔｉｏｎＭｅｃｈａｎｉｓｍ”，Ｍｏｌｅｃｕｌｅｓ，２７（２２），８０６３－８０８５，２０２２．
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００７】
蚕は、繭から脱出するために、膠に相当する繭タンパク質であるセリシンを分解する酵素であるコクナーゼを分泌する。したがって、絹糸の精錬の際にもこのコクナーゼを利用するのが最も好ましいと考えられる。しかし、コクナーゼは蚕が繭から脱出する際の一時期間だけしか産生されず、また、１匹の蚕が産生するコクナーゼの量は微量である。そのため、大量の生糸を処理するだけのコクナーゼを蚕から得るのは困難である。
【０００８】
そこで、工業的な遺伝子組換えによるコクナーゼの産生が試みられている。遺伝子組換えコクナーゼを大腸菌から産生させた場合、多くは酵素活性のない不活性な前駆体タンパク質として産生される。従って、酵素活性を獲得するためには、立体構造形成反応および酵素活性化反応が必要である。しかしながら、コクナーゼは酵素蛋白質であるため、この立体構造形成及び酵素活性化反応時に非特異的な自己分解を起こしてしまい、結果として活性を持つコクナーゼの回収率が著しく低いという課題があった。
【課題を解決するための手段】
【０００９】
本発明は上記の課題に鑑みて想到されたものであり、立体構造形成および酵素活性反応によって非特異的な自己分解を起こさない遺伝子組換えコクナーゼを提供する。
【００１０】
より具体的に本発明に係る遺伝子組換えコクナーゼは、配列番号３のアミノ酸配列を有する不活性状態のコクナーゼ（前駆体タンパク質：プロコクナーゼ）から得られたことを特徴とする。また、この前駆体タンパク質も本発明に含まれる。なお本発明に係るタンパク質および前駆体タンパク質をそれぞれ「遺伝子組換え前駆体コクナーゼ又は遺伝子組換えプロコクナーゼ」と呼ぶ場合もある。
【発明の効果】
（【００１１】以降は省略されています）

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