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公開番号2025098278
公報種別公開特許公報(A)
公開日2025-07-01
出願番号2025061682,2022130662
出願日2025-04-03,2020-11-17
発明の名称細胞構造体及びその製造方法並びに被験物質の肝毒性の評価方法
出願人TOPPANホールディングス株式会社,国立大学法人大阪大学
代理人個人,個人,個人,個人
主分類C12N 5/071 20100101AFI20250624BHJP(生化学;ビール;酒精;ぶどう酒;酢;微生物学;酵素学;突然変異または遺伝子工学)
要約【課題】肝毒性を有する物質に対する応答性に優れる細胞構造体を提供すること。
【解決手段】肝細胞と血管内皮細胞とを少なくとも含む細胞と、細胞外マトリックス成分とを含み、細胞の間に細胞外マトリックス成分が配置され、細胞の間に肝類洞網を有する、細胞構造体。
【選択図】なし

特許請求の範囲【請求項１】
肝細胞と血管内皮細胞とを少なくとも含む細胞と、フィブリンと、細胞外マトリックス成分とを含み、
前記細胞の間に前記細胞外マトリックス成分が配置され、
前記細胞の間に肝類洞網を有し、
前記細胞を含む細胞集合体が前記フィブリンに内包されており、
前記肝細胞が、初代肝細胞、前記初代肝細胞を培養した細胞、及び前記初代肝細胞を株化した培養細胞株からなる群より選択される少なくとも１種である、細胞構造体。
続きを表示（約 570 文字）【請求項２】
前記細胞の総数に対する、前記肝細胞の数の比率が６０％以上８０％以下である、請求項１に記載の細胞構造体。
【請求項３】
前記細胞の総数に対する、前記血管内皮細胞の数の比率が５％以上３５％以下である、請求項１又は２に記載の細胞構造体。
【請求項４】
前記細胞構造体が高分子電解質を更に含む、請求項１～３のいずれか一項に記載の細胞構造体。
【請求項５】
前記高分子電解質がヘパリンである、請求項４に記載の細胞構造体。
【請求項６】
前記細胞外マトリックス成分が線維状である、請求項１～５のいずれか一項に記載の細胞構造体。
【請求項７】
前記細胞外マトリックス成分がコラーゲン成分を含む、請求項１～６のいずれか一項に記載の細胞構造体。
【請求項８】
前記細胞外マトリックス成分が、断片化された細胞外マトリックス成分を含む、請求項１～７のいずれか一項に記載の細胞構造体。
【請求項９】
前記血管内皮細胞が類洞内皮細胞である、請求項１～８のいずれか一項に記載の細胞構造体。
【請求項１０】
前記細胞が、肝星細胞を更に含む、請求項１～９のいずれか一項に記載の細胞構造体。
（【請求項１１】以降は省略されています）
発明の詳細な説明【技術分野】
【０００１】
本発明は、細胞構造体及びその製造方法並びに被験物質の肝毒性の評価方法に関する。
続きを表示（約 3,400 文字）【背景技術】
【０００２】
薬物性肝障害（ＤＩＬＩ）は、医薬品の開発／販売中止の主要因である。ＤＩＬＩの作用機序は複雑且つ多岐に渡り、ヒト特有の生体反応によって発現する毒性も少なからず存在するため、動物試験ではその事前予測が必ずしも容易ではない。従って、そのようなヒト特有に発現する毒性の事前予測を行う代替ツールとして類肝組織が求められている。
【０００３】
人工的に生体組織を模した構造体を作製する手法として、例えば、培養細胞の表面全体が接着膜で被覆された被覆細胞を培養することによって、三次元組織体を製造する方法（特許文献１）、細胞をカチオン性物質および細胞外マトリックス成分と混合して混合物を得て、得られた混合物から細胞を集めて、基材上に細胞集合体を形成することを含む、立体的細胞組織の製造方法（特許文献２）等が知られている。また、本発明者らは、細胞と内因性コラーゲンを接触させ、好ましくはさらに繊維性の外因性コラーゲンを接触させて、コラーゲン濃度が高い三次元組織体を製造する方法（特許文献３）を提案している。
【先行技術文献】
【特許文献】
【０００４】
特開２０１２－１１５２５４号公報
国際公開第２０１７／１４６１２４号
国際公開第２０１８／１４３２８６号
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００５】
血管構造等の高次組織形態を三次元的に再現し、正確な毒性評価を可能とし得るｉｎｖｉｔｒｏ類肝組織は未だ構築されていない。
【０００６】
本発明の目的は、肝毒性を有する物質に対する応答性に優れる細胞構造体及びその製造方法を提供することにある。
【課題を解決するための手段】
【０００７】
すなわち、本発明は、例えば以下の各発明に関する。
［１］
肝細胞と血管内皮細胞とを少なくとも含む細胞と、細胞外マトリックス成分とを含み、
上記細胞の間に上記細胞外マトリックス成分が配置され、
上記細胞の間に肝類洞網を有する、細胞構造体。
［２］
上記細胞の総数に対する、上記肝細胞の数の比率が６０％以上８０％以下である、［１］に記載の細胞構造体。
［３］
上記細胞の総数に対する、上記血管内皮細胞の数の比率が５％以上３５％以下である、［１］又は［２］に記載の細胞構造体。
［４］
上記細胞外マトリックス成分が線維状である、［１］～［３］のいずれかに記載の細胞構造体。
［５］
上記細胞外マトリックス成分がコラーゲン成分を含む、［１］～［４］のいずれかに記載の細胞構造体。
［６］
高分子電解質を含む、［１］～［５］のいずれかに記載の細胞構造体。
［７］
上記細胞外マトリックス成分が、断片化された細胞外マトリックス成分を含む、［１］～［６］のいずれかに記載の細胞構造体。
［８］
上記血管内皮細胞が類洞内皮細胞である、［１］～［７］のいずれかに記載の細胞構造体。
［９］
上記細胞が、肝星細胞を更に含む、［１］～［８］のいずれかに記載の細胞構造体。
［１０］
［１］～［９］のいずれかに記載の細胞構造体を、被験物質と接触させた状態で培養する培養工程を備え、
上記培養工程後における、上記細胞構造体の細胞生存数、アルブミン生産量、アデノシン三リン酸含有量、又は肝類洞網を指標として、肝毒性の有無又は程度を評価する、被験物質の肝毒性の評価方法。
［１１］
上記培養工程が、上記被験物質を含有する培地中で上記細胞構造体を培養することにより行われる、［１０］に記載の被験物質の肝毒性の評価方法。
［１２］
肝細胞と血管内皮細胞とを少なくとも含む細胞と、細胞外マトリックス成分とを、水性媒体中で接触させる接触工程と、
上記細胞外マトリックス成分と接触させた上記細胞を培養する培養工程と、を備え、
上記接触工程が、水性媒体中での上記細胞外マトリックス成分の凝集が抑制された条件で行われ、
上記培養工程が、肝非実質細胞の培養に適した条件で行われる、細胞構造体の製造方法。
［１３］
上記細胞外マトリックス成分が線維状である、［１２］に記載の細胞構造体の製造方法。
［１４］
上記接触工程が、上記細胞と、上記細胞外マトリックス成分と、高分子電解質とを混合することにより行われる、［１２］又は［１３］に記載の細胞構造体の製造方法。
［１５］
上記高分子電解質が、ヘパリンである、［１４］に記載の細胞構造体の製造方法。
［１６］
接触工程が、上記細胞と、上記細胞外マトリックス成分との接触後に、上記細胞及び上記細胞外マトリックス成分を集積させることを含む、［１２］～［１５］のいずれかに記載の細胞構造体の製造方法。
［１７］
上記細胞外マトリックス成分が、コラーゲン成分を含む、［１２］～［１６］のいずれかに記載の細胞構造体の製造方法。
［１８］
上記細胞外マトリックス成分が、断片化された細胞外マトリックス成分を含む、［１２］～［１７］のいずれかに記載の細胞構造体の製造方法。
［１９］
上記断片化された細胞外マトリックス成分が解繊された細胞外マトリックス成分である、［１８］に記載の細胞構造体の製造方法。
［２０］
上記血管内皮細胞が類洞内皮細胞である、［１２］～［１９］のいずれかに記載の細胞構造体の製造方法。
［２１］
上記細胞が、肝星細胞を更に含む、［１２］～［２０］のいずれかに記載の細胞構造体の製造方法。
［２２］
【発明の効果】
【０００８】
本発明によれば、肝毒性を有する物質に対する応答性に優れる細胞構造体及びその製造方法を提供することができる。
【０００９】
本発明の細胞構造体は、肝機能を比較的長期間（例えば、２週間以上）維持することが可能である。本発明の細胞構造体を用いることにより、被験物質の肝毒性を評価することが可能である。
【図面の簡単な説明】
【００１０】
ＣＤ３１染色及びアルブミン染色による実施例１の細胞構造体の顕微鏡観察結果を示す写真である。
ＣＤ３１染色及びアルブミン染色による実施例２の細胞構造体の顕微鏡観察結果を示す写真である。
ＣＤ３１染色及びアルブミン染色による実施例３の細胞構造体の顕微鏡観察結果を示す写真である。
ＣＤ３１染色及びアルブミン染色による実施例４の細胞構造体の顕微鏡観察結果を示す写真である。
ＣＤ３１染色及びアルブミン染色による実施例５の細胞構造体の顕微鏡観察結果を示す写真である。
ＣＤ３１染色及びアルブミン染色による比較例１の細胞構造体の顕微鏡観察結果を示す写真である。
ＣＤ３１染色による実施例６の細胞構造体の顕微鏡観察結果を示す写真である。
ＣＤ３１染色による実施例７の細胞構造体の顕微鏡観察結果を示す写真である。
ＣＤ３１染色による実施例８の細胞構造体の顕微鏡観察結果を示す写真である。
アルブミン分泌量の測定結果を示すグラフである。
Ｎｅｆａｄａｚｏｎｅに対する応答性の評価結果を示すグラフである。
Ｔｒｏｇｌｉｔａｚｏｎｅに対する応答性の評価結果を示すグラフである。
モノクロタリン投与実験の結果を示す写真である。
モノクロタリン投与実験の結果を示す写真であり、図１３の拡大写真である。
モノクロタリン投与実験における肝類洞網の解析結果を示すグラフである。
モノクロタリン投与実験におけるＡＴＰアッセイの結果を示すグラフである。
【発明を実施するための形態】
（【００１１】以降は省略されています）

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