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公開番号2025097978
公報種別公開特許公報(A)
公開日2025-07-01
出願番号2025022451,2023172195
出願日2025-02-14,2019-06-12
発明の名称サイトメトリーのための方法及びシステム
出願人シンクサイト株式会社,国立大学法人東京大学,国立大学法人大阪大学
代理人個人,個人
主分類G01N 15/1429 20240101AFI20250624BHJP(測定;試験)
要約【課題】空間分解検出器を使用せずに物体のイメージを生成するために使用され得るゴーストサイトメトリーのための方法及びシステムを提供する。
【解決手段】パターン化された光学構造に対する細胞の運動から取得された空間情報は、単一ピクセル検出器に順次到達する信号に圧縮変換され得る。時間波形とランダム又は擬似ランダムパターンの強度分布との組み合わせ使用は、細胞形態の、コンピュータによる再構成を可能にし得る。機械学習方法は、効率的なイメージフリーの形態ベースのサイトメトリーを可能にするために、イメージ再構成なしに、圧縮された波形に直接適用され得る。イメージフリーGCは、従来のフローサイトメーターを使用して困難であった、特定のバイオマーカーを伴わない細胞形態に基づく正確かつハイスループットの細胞分類及び選択的選別を達成し得る。
【選択図】図1A
特許請求の範囲【請求項１】
（ａ）パターン化された光学構造に対する粒子の運動中に空間情報を取得するステップと、（ｂ）前記空間情報を、検出器に順次到達する信号に圧縮変換するステップと、（ｃ）前記信号を使用して、少なくとも７０％の精度で前記粒子の少なくともサブセットを識別するステップと、（ｄ）（ｃ）で識別された前記粒子の前記少なくともサブセットを、少なくとも１０粒子／秒の速度で１つ又は複数のグループに選別するステップとを含む、粒子処理又は分析のための方法。
続きを表示（約 790 文字）【請求項２】
（ａ）が、（ｉ）光源からの光を前記パターン化された光学構造を通して方向付けるステップと、（ｉｉ）前記パターン化された光学構造からの光を前記粒子に方向付けるステップと、（ｉｉｉ）前記粒子からの光を前記検出器に方向付けるステップとを含む、請求項１に記載の方法。
【請求項３】
（ａ）が、（ｉ）光源からの光を前記粒子に方向付けるステップと、（ｉｉ）前記粒子からの光を前記パターン化された光学構造を通して方向付けるステップと、（ｉｉｉ）前記パターン化された光学構造からの光を前記検出器に方向付けるステップとを含む、請求項１又は２に記載の方法。
【請求項４】
前記光が紫外光又は可視光を含む、請求項２又は３に記載の方法。
【請求項５】
（ｂ）が、２段階反復収縮／閾値化（ＴｗＩＳＴ）手順を適用するステップを含む、請求項１から３の何れか一項に記載の方法。
【請求項６】
（ｃ）が、前記パターン化された光学構造によって付与された１つ又は複数の強度分布を含む１つ又は複数の時間波形の組み合わせ使用によって少なくとも部分的に前記粒子の形態をコンピュータ的に再構成するステップを含む、請求項１から５の何れか一項に記載の方法。
【請求項７】
前記粒子が１つ又は複数の生物学的粒子を含む、請求項１から６の何れか一項に記載の方法。
【請求項８】
前記粒子が１つ又は複数の細胞を含む、請求項１から７の何れか一項に記載の方法。
【請求項９】
前記粒子が１つ又は複数の希少細胞を含む、請求項１から８の何れか一項に記載の方法。
【請求項１０】
前記粒子が１つ又は複数の癌細胞を含む、請求項１から９の何れか一項に記載の方法。
（【請求項１１】以降は省略されています）
発明の詳細な説明【技術分野】
【０００１】
相互参照
［００１］本出願は、２０１８年６月１３日に出願された「ＭＥＴＨＯＤＳＡＮＤＳＹＳＴＥＭＳＦＯＲＣＹＴＯＭＥＴＲＹ」と題する米国仮特許出願第６２／６８４，６１２号、２０１８年７月２０日に出願された「ＭＥＴＨＯＤＳＡＮＤＳＹＳＴＥＭＳＦＯＲＣＹＴＯＭＥＴＲＹ」と題する米国仮特許出願第６２／７０１，３９５号、２０１９年２月１２日に出願された「ＭＥＴＨＯＤＳＡＮＤＳＹＳＴＥＭＳＦＯＲＣＹＴＯＭＥＴＲＹ」と題する米国仮特許出願第６２／８０４，５６０号、及び２０１９年５月１５日に出願された「ＭＥＴＨＯＤＳＡＮＤＳＹＳＴＥＭＳＦＯＲＣＹＴＯＭＥＴＲＹ」と題する米国仮特許出願第６２／８４８，４７８，４７８号の利益を主張するものであり、これらの各々は、全ての目的のためにその全体が参照により本明細書に組み込まれる。
続きを表示（約 4,100 文字）【背景技術】
【０００２】
［００２］フローサイトメトリーは、細胞計数、細胞選別、バイオマーカー検出及びタンパク質工学における使用のために使用され得る技術である。フローサイトメトリーは、流体の流れに細胞を懸濁させ、電子検出装置に細胞を通過させることによって実施することができる。フローサイトメーターは、粒子の物理的及び化学的特性の同時マルチパラメータ分析を可能にし得る。
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００３】
［００３］本開示は、ゴーストサイトメトリー（ＧＣ）と呼ばれるプロセスを使用する形態ベースの細胞分類及び選別のための方法及びシステムを提供する。本開示の方法及びシステムは、イメージを取得することなく、高い精度及びスループットで形態ベースの細胞分類及び選別を達成するために使用され得る。
【課題を解決するための手段】
【０００４】
［００４］一態様では、本開示は、（ａ）パターン化された光学構造に対する粒子の運動中に空間情報を取得するステップと、（ｂ）空間情報を、検出器に順次到達する信号に圧縮変換するステップと、（ｃ）信号を使用して、少なくとも７０％の任意の精度で粒子の少なくともサブセットを識別するステップと、（ｄ）（ｃ）で識別された粒子の少なくともサブセットを、少なくとも１０粒子／秒の速度で１つ又は複数のグループに選別するステップとを含む、粒子処理又は分析のための方法を提供する。いくつかの実施形態では、（ａ）は、（ｉ）光源からの光をランダム又は擬似ランダムにパターン化された光学構造を通して方向付けるステップと、（ｉｉ）パターン化された光学構造からの光を粒子に方向付けるステップと、（ｉｉｉ）粒子からの光を検出器に方向付けるステップとを含む。いくつかの実施形態では、（ａ）は、（ｉ）光源からの光を粒子に方向付けるステップと、（ｉｉ）パターン化された光学構造を通して粒子からの光を方向付けるステップと、（ｉｉｉ）パターン化された光学構造からの光を検出器に方向付けるステップとを含む。いくつかの実施形態では、光は紫外光又は可視光を含む。いくつかの実施形態では、（ｂ）は、２段階反復収縮／閾値化（ＴｗＩＳＴ）手順を適用するステップを含む。いくつかの実施形態では、（ｃ）は、パターン化された光学構造によって付与された１つ又は複数の強度分布を含む時間波形の組み合わせ使用によって少なくとも部分的に粒子の形態をコンピュータ的に再構成するステップを含む。いくつかの実施形態では、粒子は、１つ又は複数の生物学的粒子を含む。いくつかの実施形態では、粒子は、１つ又は複数の細胞を含む。いくつかの実施形態では、粒子は、１つ又は複数の希少細胞を含む。いくつかの実施形態では、粒子は、１つ又は複数の癌細胞を含む。いくつかの実施形態では、粒子は、１つ又は複数の循環腫瘍細胞を含む。いくつかの実施形態では、（ｃ）は、粒子の少なくともサブセットを識別するために、信号に対応する圧縮波形に１つ又は複数の機械学習分類器を適用するステップを含む。いくつかの実施形態では、１つ又は複数の機械学習分類器は、サポートベクターマシン、ランダムフォレスト、人工ニューラルネットワーク、畳み込みニューラルネットワーク、深層学習、超深層学習、勾配ブースティング、アダブースティング、決定木、線形回帰、及びロジスティック回帰から成る群から選択される。いくつかの実施形態では、粒子は、イメージ再構成なしで分析される。いくつかの実施形態では、検出器は単一ピクセル検出器を含む。いくつかの実施形態では、単一ピクセル検出器は、光電子増倍管を備える。いくつかの実施形態では、方法は、粒子の１つ又は複数のイメージを再構成するステップをさらに含む。いくつかの実施形態では、１つ又は複数のイメージは蛍光イメージを含む。いくつかの実施形態では、方法は、粒子の複数のイメージを再構成するステップをさらに含み、複数の各イメージは、異なる波長又は波長範囲を含む。いくつかの実施形態では、１つ又は複数のイメージは、ぼけアーチファクトがない。いくつかの実施形態では、粒子は、パターン化された光学構造に対して少なくとも１ｍ／ｓの速度で移動する。いくつかの実施形態では、方法は、粒子の形態に基づいて、粒子を１つ又は複数のグループの選別された粒子に選別するステップをさらに含む。いくつかの実施形態では、速度は少なくとも１００粒子／秒である。いくつかの実施形態では、速度は少なくとも１，０００粒子／秒である。いくつかの実施形態では、（ｄ）は、濃縮された粒子混合物を生成するために１つ又は複数のグループを収集するステップを含む。いくつかの実施形態では、１つ又は複数のグループは、少なくとも７０％の純度を有する。いくつかの実施形態では、方法は、１つ又は複数のグループの１つ又は複数の粒子を１つ又は複数のアッセイに供するステップをさらに含む。いくつかの実施形態では、１つ又は複数のアッセイは、溶解、核酸抽出、核酸増幅、核酸配列決定、及びタンパク質配列決定から成る群から選択される。いくつかの実施形態では、本方法は、（ａ）の前に、粒子を流体力学的流れ集束に供するステップを含む。いくつかの実施形態では、方法は、パターン化された光学構造に対して粒子が移動するときに、粒子の部分透過スペックルパターンを収集するステップを含む。いくつかの実施形態では、パターン化された光学構造は、規則的なパターン化された光学構造を含む。いくつかの実施形態では、パターン化された光学構造は、無秩序なパターン化された光学構造を含む。いくつかの実施形態では、無秩序な光学構造は、非周期的なパターン化された光学構造を含む。いくつかの実施形態では、無秩序な光学構造は、ランダムに又は擬似ランダムにパターン化された光学構造を含む。いくつかの実施形態では、光学構造は静的光学構造を含む。
【０００５】
［００５］別の態様では、本開示は、少なくとも７０％の精度で非天然標識を使用することなく、粒子の形態に少なくとも部分的に基づいて粒子を分類又は選別するためのイメージフリーの方法を提供する。いくつかの実施形態では、粒子は、１つ又は複数の生物学的粒子を含む。いくつかの実施形態では、粒子は、１つ又は複数の細胞を含む。いくつかの実施形態では、粒子は、１つ又は複数の希少細胞を含む。いくつかの実施形態では、粒子は、１つ又は複数の癌細胞を含む。いくつかの実施形態では、粒子は、１つ又は複数の循環腫瘍細胞を含む。
【０００６】
［００６］別の態様では、本開示は、粒子を方向付けるように構成された流体流路と、流体流路の少なくとも一部と感知通信する検出器と、検出器に動作可能に結合された１つ又は複数のコンピュータプロセッサと、を備える粒子処理又は分析のためのシステムを提供し、１つ又は複数のコンピュータプロセッサは、（ａ）ランダムに又は擬似ランダムにパターン化された光学構造に対する粒子の運動中に空間情報を取得し、（ｂ）空間情報を検出器に順次到達する信号に圧縮変換し、（ｃ）信号を使用して少なくとも７０％の任意の精度で粒子の少なくともサブセットを識別し、（ｄ）（ｃ）で識別された粒子の少なくともサブセットを少なくとも１０粒子／秒の速度で１つ又は複数のグループに選別するように個々に又はまとめてプログラムされる。いくつかの実施形態では、検出器は単一ピクセル検出器である。
【０００７】
［００７］別の態様では、本開示は、１つ又は複数のコンピュータプロセッサによる実行時に、粒子分析のための方法を実施する機械実行可能コードを含む非一時的コンピュータ可読媒体を提供し、方法は、（ａ）ランダムにパターン化された光学構造に対する粒子の運動中に空間情報を取得するステップと、（ｂ）空間情報を単一ピクセル検出器に順次到達する信号に圧縮変換するステップと、（ｃ）信号を使用して、少なくとも７０％の精度で粒子の少なくともサブセットを識別するステップと、（ｄ）（ｃ）で識別された粒子の少なくともサブセットを、少なくとも１０粒子／秒の速度で１つ又は複数のグループに選別するステップと、を含む。
【０００８】
［００８］別の態様では、本開示は、（ａ）パターン化された光学構造に対する細胞の運動中に空間情報を取得するステップと、（ｂ）空間情報を、検出器に順次到達する信号に圧縮変換するステップと、（ｃ）信号を使用して、細胞の少なくともサブセットを癌性であると識別するステップと、（ｄ）（ｃ）で識別された細胞の少なくともサブセットを、１つ又は複数のグループの癌性細胞及び１つ又は複数のグループの非癌性細胞に選別するステップとを含む、細胞処理又は分析のための方法を提供する。
【０００９】
［００９］別の態様では、本開示は、（ａ）パターン化された光学構造に対する細胞の運動中に空間情報を取得するステップと、（ｂ）空間情報を、検出器に順次到達する信号に圧縮変換するステップと、（ｃ）信号を使用して、細胞の少なくともサブセットを治療用であると識別するステップと、（ｄ）（ｃ）で識別された細胞の少なくともサブセットを、１つ又は複数のグループの治療用細胞及び１つ又は複数のグループの非治療用細胞に選別するステップとを含む、細胞処理又は分析のための方法を提供する。
【００１０】
［００１０］別の態様では、本開示は、複数の細胞から１つ又は複数の標的細胞を識別するための方法であって、（ａ）パターン化された光学構造に対する複数の細胞の運動中に空間情報を取得するステップと、（ｂ）空間情報を訓練された機械学習アルゴリズムに入力して、複数の細胞から１つ又は複数の標的細胞を識別するステップと、を含む方法を提供する。
（【００１１】以降は省略されています）

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