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公開番号2025151747
公報種別公開特許公報(A)
公開日2025-10-09
出願番号2024053313
出願日2024-03-28
発明の名称くるみアレルゲンの検査用の抗体、キットおよび検査方法
出願人日本ハム株式会社
代理人個人,個人,個人,個人,個人,個人
主分類C07K 16/16 20060101AFI20251002BHJP(有機化学)
要約【課題】免疫学的測定法に基づき食品中のくるみアレルゲンを検出するための、交差反応性について改良された手段を提供する。
【解決手段】特定の配列からなる重鎖CDR1、CDR2、CDR3および軽鎖のCDR1、CDR2、CDR3を有する、抗くるみレグミンB様タンパク質抗体またはその抗原結合性断片、食品中又は食品加工装置に残留しているくるみアレルゲンを免疫学的測定法により、定量的または定性的に検出するための該抗体等を含む検査用キット、ならびに食品中のくるみアレルゲンの検査方法を提供する。
【選択図】なし
特許請求の範囲【請求項１】
配列番号１で表されるアミノ酸配列からなる重鎖ＣＤＲ１、
配列番号２で表されるアミノ酸配列からなる重鎖ＣＤＲ２、および
配列番号３で表されるアミノ酸配列からなる重鎖ＣＤＲ３、ならびに
配列番号４で表されるアミノ酸配列からなる軽鎖ＣＤＲ１、
配列番号５で表されるアミノ酸配列からなる軽鎖ＣＤＲ２、および
配列番号６で表されるアミノ酸配列からなる軽鎖ＣＤＲ３
を有する、抗くるみレグミンＢ様タンパク質（legmin B like protein）抗体またはその抗原結合性断片（以下「第１抗体等」と呼ぶ。）、または
配列番号７で表されるアミノ酸配列からなる重鎖ＣＤＲ１、
配列番号８で表されるアミノ酸配列からなる重鎖ＣＤＲ２、および
配列番号９で表されるアミノ酸配列からなる重鎖ＣＤＲ３、ならびに
配列番号１０で表されるアミノ酸配列からなる軽鎖ＣＤＲ１、
配列番号１１で表されるアミノ酸配列からなる軽鎖ＣＤＲ２、および
配列番号１２で表されるアミノ酸配列からなる軽鎖ＣＤＲ３
を有する、抗くるみレグミンＢ様タンパク質抗体またはその抗原結合性断片（以下「第２抗体等」と呼ぶ。）。
続きを表示（約 1,400 文字）【請求項２】
くるみレグミンＢ様タンパク質との結合において、前記第１抗体等と同一または重複するエピトープをめぐって競合する抗くるみレグミンＢ様タンパク質抗体またはその抗原結合性断片（以下「第１競合抗体等」と呼ぶ。）、または前記第２抗体等と同一または重複するエピトープをめぐって競合する抗くるみレグミンＢ様タンパク質抗体またはその抗原結合性断片（以下「第２競合抗体等」と呼ぶ。）。
【請求項３】
食品中又は食品加工装置に残留しているくるみアレルゲンを免疫学的測定法により定量的または定性的に検出するための検査用キットであって、
請求項１に記載の前記第１抗体等および第２抗体等ならびに請求項２に記載の前記第１競合抗体等および第２競合抗体等からなる群より選ばれる少なくとも１つの抗体等を含む、検査用キット。
【請求項４】
前記免疫学的測定法がＥＬＩＳＡまたはイムノクロマトグラフィーであり、ＥＬＩＳＡにおける酵素標識用またはイムノクロマトグラフィーにおける発色標識用の、前記第１抗体等もしくは前記第１競合抗体等または前記第２抗体等もしくは前記第２競合抗体等を含む、請求項３に記載の検査用キット。
【請求項５】
前記免疫学的測定法がＥＬＩＳＡまたはイムノクロマトグラフィーであり、ＥＬＩＳＡにおける固相化用またはイムノクロマトグラフィーにおける固定化用の、前記第１抗体等もしくは前記第１競合抗体等または前記第２抗体等もしくは前記第２競合抗体等を含む、請求項３に記載の検査用キット。
【請求項６】
前記免疫学的測定法がＥＬＩＳＡまたはイムノクロマトグラフィーであり、
（１）ＥＬＩＳＡにおける酵素標識用またはイムノクロマトグラフィーにおける発色標識用の、前記第１抗体等もしくは前記第１競合抗体等と、ＥＬＩＳＡにおける固相化用またはイムノクロマトグラフィーにおける固定化用の、前記第２抗体等もしくは前記第２競合抗体等を含む、
（２）ＥＬＩＳＡにおける酵素標識用またはイムノクロマトグラフィーにおける発色標識用の、前記第２抗体等もしくは前記第２競合抗体等と、ＥＬＩＳＡにおける固相化用またはイムノクロマトグラフィーにおける固定化用の、前記第１抗体等もしくは前記第１競合抗体等を含む、または
（３）ＥＬＩＳＡにおける酵素標識用またはイムノクロマトグラフィーにおける発色標識用の、前記第２抗体等もしくは前記第２競合抗体等と、ＥＬＩＳＡにおける固相化用またはイムノクロマトグラフィーにおける固定化用の、前記第１抗体等、前記第２抗体等、前記第１競合抗体等および前記第２競合抗体等以外の抗くるみレグミンＢ様タンパク質抗体またはその抗原結合性断片を含む、
請求項３に記載の検査用キット。
【請求項７】
さらに抽出用試薬を含む、請求項３に記載の検査用キット。
【請求項８】
前記抽出用試薬が、界面活性剤としてアルキル硫酸塩を含む、請求項３に記載の検査用キット。
【請求項９】
前記抽出用試薬が、還元剤としてメルカプトアルカノールおよび／または亜硫酸塩を含む、請求項３に記載の検査用キット。
【請求項１０】
前記抽出用試薬が、振盪法または高速剪断・撹拌処理法による抽出用試薬である、請求項３に記載の検査用キット。
（【請求項１１】以降は省略されています）
発明の詳細な説明【技術分野】
【０００１】
本発明は、食品中に含まれている、または食品加工装置に残留している、くるみアレルゲン、特にくるみレグミンＢ様タンパク質（legmin B like protein）を検出するための技術に関する。
続きを表示（約 2,600 文字）【背景技術】
【０００２】
食物アレルギーは、身体が摂取した食物に含まれる特定のタンパク質（食物アレルゲン）を異物として認識し、過敏な免疫学的機序を介して、皮膚のかゆみ、じんましん、せきなど様々な症状が引き起こされる症状であり、重症の場合は、意識の喪失、血圧低下・ショック症状など、生命にかかわる深刻なものとなる。食物アレルギーの患者は、全人口の１～２％（乳児に限定すると約１０％）になると推定されている。食物アレルギーの患者が、原因となる食物アレルゲンを含む食品、特に外観的に判別しにくい加工品を摂取しないよう、食物アレルゲンを含む原材料を食品が含む場合は、その旨を表示することが食品衛生法により義務または推奨とされている。現在、「卵、乳、小麦、えび、かに、落花生、くるみ」（発症件数が多いもの）および「そば」（症状が重くなることが多く、生命に関わるもの）の８品目は、表示義務がある「特定原材料」に指定されており、「あわび、いか、いくら、オレンジ、カシューナッツ、キウイフルーツ、牛肉、ごま、さけ、さば、大豆、鶏肉、バナナ、豚肉、まつたけ、もも、やまいも、りんご、ゼラチン、アーモンド」（過去に一定の頻度で発症が報告されたもの）の２１品目は、表示が推奨されている「特定原材料に準ずるもの」に指定されている。消費者庁（以前は厚生労働省）は、食物アレルギーの全国的な実態把握のために３年毎に調査を行っており、その結果を踏まえて特定原材料等の見直しを行っている。
【０００３】
上記のような食物アレルゲンに関する制度の運用のために、食品メーカーや公的な検査機関等において、食物アレルゲンを含む食品が加工品中に原材料として含まれていないかまたは食品加工装置に残留していないか、キット等を使用して検査されている。くるみに対するアレルギー症状は重篤なものとなる傾向にあることから、くるみアレルゲンを検出することのできるキットにとって、より一層の信頼性の向上などが要求されている。
【０００４】
加工品中に含まれている、または食品加工装置に残留している特定原材料等の検出技術としては、一般的に、スクリーニング検査として抗原抗体反応を用いたＥＬＩＳＡ法、および確定検査としてＤＮＡの増幅反応を用いたＰＣＲ法が存在している。このうちＥＬＩＳＡ法は、くるみ特有のタンパク質（アレルゲン）を認識する抗体を用いることで、加工品中にくるみが原材料として含まれているかどうかを検査する。
【０００５】
抗原抗体反応に基づく検出の標的とするくるみ特有のタンパク質としては、くるみアレルギーの主な原因である、くるみアレルゲンＪｕｇｒ１～８が第一候補となる。たとえば、非特許文献１では、抗原抗体反応により食品中の「くるみ」を検出するための手段として、くるみアレルゲンＪｕｇｒ１（２Ｓアルブミン）タンパク質を標的とするポリクローナル抗体を用いて、ＥＬＩＳＡにより検出する方法およびそのためのキットが提案されている。長い間、抗原抗体反応に基づいて食品中のくるみを検出するための手段としては、上記のようなＪｕｇｒ１タンパク質を検出対象とする検査方法や検査キットしか実用化されていなかった。
【０００６】
しかしながら近年、特許文献１において、従来活用されていなかったくるみに含まれる２種類のタンパク質、legmin B like proteinおよびＪｕｇｒ６（ビシリン）を標的とする抗体を用いて、食品中のくるみを検出するための検査方法や検査キットが提案されており、Ｊｕｇｒ１タンパク質以外のくるみアレルゲンを検出対象とする検査方法や検査キットの実用化の可能性が示されている。
【０００７】
ここで、抗体を用いて標的タンパク質（食物アレルゲン）を検出する際には、交差抗原性、すなわち標的として意図されていないタンパク質に対する抗体の結合性により、標的タンパク質が食品中に含まれるか否かの判定が影響を受けることが問題となる。例えば、非特許文献２では、様々な食物アレルゲン同士の交差抗原性について検討されており、くるみのＪｕｇｒ１（２Ｓアルブミン）タンパク質を標的とするポリクローナル抗体を用いたＥＬＩＳＡ法においてピーカンナッツとの交差反応性が認められたことが記載されている。クルミタンパク質とピーカンナッツタンパク質の交差反応性は、それらに含まれる２Ｓグロブリン（Ｊｕｇｒ１）、７Ｓグロブリン（Ｊｕｇｒ２、ビシリン様グロブリン）、１１Ｓグロブリン（Ｊｕｇｒ４）等のタンパク質のアミノ酸配列の相同性が非常に高い（９５％以上）ことに起因する。そのため、食品中のくるみアレルゲンを検出するための従来の検査方法や検査キットは、食品がくるみタンパク質を含まずピーカンナッツタンパク質を含むときであっても陽性となったり、食品がくるみタンパク質とピーカンナッツタンパク質の両方を含むときに陰性となったりする（くるみタンパク質のみに反応する抗体と、クルミタンパク質およびピーカンナッツタンパク質の両方に反応する抗体を組み合わせて使用している場合）問題があった。
【先行技術文献】
【特許文献】
【０００８】
特開２０２２－１５７０３２号公報
【非特許文献】
【０００９】
Sakai et al., Journal of AOAC international, 93(4), pp.1255-1261, 2010
厚生労働科学研究費補助金食品の安心・安全確保推進研究事業「食品中に含まれるアレルギー物質の検査法開発に関する研究」平成１８年度総括・分担研究報告書（H17-食品-011），２００７年４月
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【００１０】
前述したように、免疫学的測定法に基づき食品中のくるみアレルゲンを検出するためのキットや方法には、用いる抗体による、くるみタンパク質とピーカンナッツタンパク質の交差抗原性の面から、改善の余地があった。
（【００１１】以降は省略されています）

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