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公開番号2025059900
公報種別公開特許公報(A)
公開日2025-04-10
出願番号2023170285
出願日2023-09-29
発明の名称落花生アレルゲンの検査用の抗体、キットおよび検査方法
出願人日本ハム株式会社
代理人個人,個人,個人,個人,個人,個人
主分類C07K 16/16 20060101AFI20250403BHJP(有機化学)
要約【課題】食品中又は食品加工装置に残留している落花生アレルゲンを検出するための改良された手段を提供する。
【解決手段】食品中又は食品加工装置に残留している落花生アレルゲンを免疫学的測定法により定量的または定性的に検出するための検査用キットであって、所定のアミノ酸配列からなる重鎖CDR1～3および軽鎖CDR1～3を有する抗Ara h3抗体またはその抗原結合性断片(抗Ara h3抗体等)、あるいはAra h3タンパク質との結合において抗Ara h3抗体等と同一または重複するエピトープをめぐって競合する抗Ara h3抗体またはその抗原結合性断片(抗Ara h3競合抗体等)を含む、検査用キット。
【選択図】なし
特許請求の範囲【請求項１】
配列番号１で表されるアミノ酸配列からなる重鎖ＣＤＲ１、
配列番号２で表されるアミノ酸配列からなる重鎖ＣＤＲ２、および
配列番号３で表されるアミノ酸配列からなる重鎖ＣＤＲ３、ならびに
配列番号４で表されるアミノ酸配列からなる軽鎖ＣＤＲ１、
配列番号５で表されるアミノ酸配列からなる軽鎖ＣＤＲ２、および
配列番号６で表されるアミノ酸配列からなる軽鎖ＣＤＲ３
を有する、抗Ａｒａｈ３抗体またはその抗原結合性断片（以下「第１抗体等」と呼ぶ。）、または
配列番号７で表されるアミノ酸配列からなる重鎖ＣＤＲ１、
配列番号８で表されるアミノ酸配列からなる重鎖ＣＤＲ２、および
配列番号９で表されるアミノ酸配列からなる重鎖ＣＤＲ３、ならびに
配列番号１０で表されるアミノ酸配列からなる軽鎖ＣＤＲ１、
配列番号１１で表されるアミノ酸配列からなる軽鎖ＣＤＲ２、および
配列番号１２で表されるアミノ酸配列からなる軽鎖ＣＤＲ３
を有する、抗Ａｒａｈ３抗体またはその抗原結合性断片（以下「第２抗体等」と呼ぶ。）。
続きを表示（約 1,600 文字）【請求項２】
Ａｒａｈ３タンパク質との結合において、前記第１抗体等と同一または重複するエピトープをめぐって競合する抗Ａｒａｈ３抗体またはその抗原結合性断片（以下「第１競合抗体等」と呼ぶ。）、または前記第２抗体等と同一または重複するエピトープをめぐって競合する抗Ａｒａｈ３抗体またはその抗原結合性断片（以下「第２競合抗体等」と呼ぶ。）。
【請求項３】
食品中又は食品加工装置に残留している落花生アレルゲンを免疫学的測定法により定量的または定性的に検出するための検査用キットであって、
請求項１に記載の前記第１抗体等および前記第２抗体等ならびに請求項２に記載の前記第１競合抗体等および前記第２競合抗体等からなる群より選ばれる少なくとも１つを含む、検査用キット。
【請求項４】
前記免疫学的測定法がＥＬＩＳＡまたはイムノクロマトグラフィーであり、ＥＬＩＳＡにおける酵素標識用またはイムノクロマトグラフィーにおける発色標識用の、前記第１抗体等もしくは前記第１競合抗体等または前記第２抗体等もしくは前記第２競合抗体等を含む、請求項３に記載の検査用キット。
【請求項５】
前記免疫学的測定法がＥＬＩＳＡまたはイムノクロマトグラフィーであり、ＥＬＩＳＡにおける固相化用またはイムノクロマトグラフィーにおける固定化用の、前記第１抗体等もしくは前記第１競合抗体等または前記第２抗体等もしくは前記第２競合抗体等を含む、請求項３に記載の検査用キット。
【請求項６】
前記免疫学的測定法がＥＬＩＳＡまたはイムノクロマトグラフィーであり、
（１）ＥＬＩＳＡにおける酵素標識用またはイムノクロマトグラフィーにおける発色標識用の、前記第２抗体等もしくは前記第２競合抗体等と、ＥＬＩＳＡにおける固相化用またはイムノクロマトグラフィーにおける固定化用の、前記第２抗体等もしくは前記第２競合抗体等を含む、
（２）ＥＬＩＳＡにおける酵素標識用またはイムノクロマトグラフィーにおける発色標識用の、前記第１抗体等もしくは前記第１競合抗体等と、ＥＬＩＳＡにおける固相化用またはイムノクロマトグラフィーにおける固定化用の、前記第２抗体等もしくは前記第２競合抗体等を含む、または
（３）ＥＬＩＳＡにおける酵素標識用またはイムノクロマトグラフィーにおける発色標識用の、前記第１抗体等もしくは前記第１競合抗体等と、ＥＬＩＳＡにおける固相化用またはイムノクロマトグラフィーにおける固定化用の、前記第１抗体等、第２抗体等、第１競合抗体等および第２競合抗体等以外の抗Ａｒａｈ３抗体またはその抗原結合性断片を含む、請求項３に記載の検査用キット。
【請求項７】
さらに抽出用試薬を含む、請求項３に記載の検査用キット。
【請求項８】
前記抽出用試薬が、加熱を伴わない振盪法または高速剪断・撹拌処理法による抽出用試薬である、請求項７に記載の検査用キット。
【請求項９】
（１）食品中又は食品加工装置に残留している落花生タンパク質を抽出する工程、および
（２）得られた抽出物中のＡｒａｈ３タンパク質を、請求項１に記載の前記第１抗体等および前記第２抗体等ならびに請求項２に記載の前記第１競合抗体等および前記第２競合抗体等からなる群より選ばれる少なくとも１つを用いた免疫学的測定法により定量的または定性的に検出する工程
を含む、食品中の落花生アレルゲンの検査方法。
【請求項１０】
前記免疫学的測定法がＥＬＩＳＡまたはイムノクロマトグラフィーであり、ＥＬＩＳＡにおける酵素標識用またはイムノクロマトグラフィーにおける発色標識用の、前記第１抗体等もしくは前記第１競合抗体等または前記第２抗体等もしくは前記第２競合抗体等を用いる、請求項９に記載の検査方法。
（【請求項１１】以降は省略されています）
発明の詳細な説明【技術分野】
【０００１】
本発明は、食品中に含まれている、または食品加工装置に残留している、落花生アレルゲン、特にＡｒａｈ３タンパク質を検出するための技術に関する。
続きを表示（約 2,400 文字）【背景技術】
【０００２】
食物アレルギーは、身体が摂取した食物に含まれる特定のタンパク質（食物アレルゲン）を異物として認識し、過敏な免疫学的機序を介して、皮膚のかゆみ、じんましん、せきなど様々な症状が引き起こされる症状であり、重症の場合は、意識の喪失、血圧低下・ショック症状など、生命にかかわる深刻なものとなる。食物アレルギーの患者は、全人口の１～２％（乳児に限定すると約１０％）になると推定されている。食物アレルギーの患者が、原因となる食物アレルゲンを含む食品、特に外観的に判別しにくい加工品を摂取しないよう、食物アレルゲンを含む原材料を食品が含む場合は、その旨を表示することが食品衛生法により義務または推奨とされている。現在、「卵、乳、小麦、えび、かに、落花生、くるみ」（発症件数が多いもの）および「そば」（症状が重くなることが多く、生命に関わるもの）の８品目は、表示義務がある「特定原材料」に指定されており、「あわび、いか、いくら、オレンジ、カシューナッツ、キウイフルーツ、牛肉、ごま、さけ、さば、大豆、鶏肉、バナナ、豚肉、まつたけ、もも、やまいも、りんご、ゼラチン、アーモンド」（過去に一定の頻度で発症が報告されたもの）の２１品目は、表示が推奨されている「特定原材料に準ずるもの」に指定されている。消費者庁（以前は厚生労働省）は、食物アレルギーの全国的な実態把握のために３年毎に調査を行っており、その結果を踏まえて特定原材料等の見直しを行っている。
【０００３】
上記のような食物アレルゲンに関する制度の運用のために、食品メーカーや公的な検査機関等において、食物アレルゲンを含む食品が加工品中に原材料として含まれていないかまたは食品加工装置に残留していないか、キット等を使用して検査されている。落花生に対するアレルギー症状は重篤なものとなる傾向にあることから、落花生アレルゲンを検出することのできるキットにとって、より一層の信頼性の向上などが要求されている。
【０００４】
加工品中に含まれている、または食品加工装置に残留している特定原材料等の検出技術としては、一般的に、スクリーニング検査として抗原抗体反応を用いたＥＬＩＳＡ法、および確定検査としてＤＮＡの増幅反応を用いたＰＣＲ法が存在している。このうちＥＬＩＳＡ法は、落花生特有のタンパク質（アレルゲン）を認識する抗体を用いることで、加工品中に落花生が原材料として含まれているかどうかを検査する。
【０００５】
抗原抗体反応に基づく検出の標的とする落花生特有のタンパク質としては、落花生アレルギーの主な原因である、落花生アレルゲンＡｒａｈ１、Ａｒａｈ２、Ａｒａｈ３などが知られている。Ａｒａｈ１は、分子量６３ｋＤａの、７ｓグロブリンファミリーのタンパク質であり、ピーナッツ抽出物の総タンパク質の約１２～１６％を占め、このアレルギー患者の３５～９５％で感作を引き起こす。Ａｒａｈ２は、分子量２０ｋＤａの、２ｓグロブリンファミリーのタンパク質であり、全身アレルギーを引き起こすことに加えて、高温で処理されたときにはトリプシンインヒビター活性がさらに数倍増強され、Ａｒａｈ１の消化を阻害することで、さらにアレルギー活性が高まる。Ａｒａｈ３は、分子量５８ｋＤａの、１１ｓグロブリンファミリーのタンパク質であり、ピーナッツ抽出物の総タンパク質の約１９％を占め、全身アレルギーを引き起こす。その他、Ａｒａｈ４、Ａｒａｈ５、Ａｒａｈ６、Ａｒａｈ７などの落花生アレルゲンも知られている。
【０００６】
そのような落花生特有のタンパク質を対象として、抗原抗体反応により食品中の落花生を検出するための手段としては、例えば、落花生アレルゲン未変性Ａｒａｈ１タンパク質および加熱変性Ａｒａｈ１タンパク質を認識する抗Ａｒａｈ１タンパク質モノクローナル抗体を用いて、ＥＬＩＳＡ等により検出する方法およびそのためのキットが提案されている（特許文献１）。
【０００７】
また、インドネシア産ＢａｌｉＰｅａｎｕｔはＡｒａｈ１を持っていない特種な落花生であるが、その他落花生由来アレルゲン（Ａｒａｈ２、Ａｒａｈ３など）が依然に含まれているため、アレルギーの発症状況は普通落花生と変わりがなかったことが報告されている（非特許文献１）。
【先行技術文献】
【特許文献】
【０００８】
特開２００９－２７１０９１号公報（特許第５０４３０７７号）
【非特許文献】
【０００９】
Peanut varieties with reduced Ara h 1 content indicating no reduced allergenicity, Mol. Nutr. Food Res. 2010, 54, 381-387
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【００１０】
Ａｒａｈ１タンパク質を標的とするモノクローナル抗体を用いた検出用キットまたは検出方法は、食品検体中のＡｒａｈ１タンパク質の濃度が低いときには検出感度が悪く、一方で食品検体中のＡｒａｈ１タンパク質の濃度が高いときには偽陰性となって検出できないといった問題点があった。また、食品がＡｒａｈ１欠損落花生を用いて製造されている場合は、Ａｒａｈ１タンパク質を標的とするモノクローナル抗体を用いた検出用キットまたは検出方法によっては落花生アレルゲンを検出できず、Ａｒａｈ２、Ａｒａｈ３タンパク質のアレルギー患者にとって大きな問題となる。さらに、落花生中の主要アレルゲンタンパク質であるＡｒａｈ１の含有量は加熱よって増減するため、Ａｒａｈ１の検査キットで落花生を検出しにくい問題がある。
（【００１１】以降は省略されています）

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