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公開番号2025118907
公報種別公開特許公報(A)
公開日2025-08-13
出願番号2025082516,2022550711
出願日2025-05-16,2021-02-24
発明の名称1H-NMR分光法を使用した治療用タンパク質の修飾度の決定方法
出願人武田薬品工業株式会社
代理人個人,個人,個人,個人,個人,個人,個人,個人,個人,個人
主分類G01N 24/08 20060101AFI20250805BHJP(測定;試験)
要約【課題】溶液中のタンパク質-第1ポリマーコンジュゲートに共有結合した第1ポリマーの平均数を決定するための方法を提供する。
【解決手段】a)タンパク質-第1ポリマーコンジュゲートを含む溶液に対して¹H核磁気共鳴の測定を実施する工程、b)当該¹H核磁気共鳴の測定値を処理する工程、c)第1種プロトンピークにおける当該¹H核磁気共鳴の測定値を積分する工程、d)c)の当該結果を較正する工程、e)第2種プロトンピークにおける当該¹H核磁気共鳴の測定値を積分する工程であって、当該第2種プロトンピークが、第1ポリマー中の少なくとも1つのプロトンによって生成されたシグナルを含む、工程、f)e)の結果を、第1ポリマーのモノマー当たりの第2種プロトンの数で割る工程、およびg)f)の結果を、第1ポリマー中のモノマーの平均数で割る工程を含む。
【選択図】図1
特許請求の範囲【請求項１】
溶液中のタンパク質－第１ポリマーコンジュゲートに共有結合した第１ポリマーの平均数を決定する方法であって、
ａ）前記タンパク質－第１ポリマーコンジュゲートを含む前記溶液に対して
１
Ｈ核磁気共鳴の測定を実施する工程、
ｂ）前記
１
Ｈ核磁気共鳴の測定値を処理する工程、
ｃ）第１種プロトンピークにおける前記
１
Ｈ核磁気共鳴の測定値を積分する工程であって、前記第１種プロトンピークが、前記タンパク質－第１ポリマーコンジュゲート中の少なくとも１つのアミノ酸の側鎖上の少なくとも１つのプロトンによって生成されたシグナルを含む、工程、
ｄ）前記ｃ）の結果を較正する工程、
ｅ）第２種プロトンピークにおける前記
１
Ｈ核磁気共鳴の測定値を積分する工程であって、前記第２種プロトンピークが、前記第１ポリマー中の少なくとも１つのプロトンによって生成されたシグナルを含む、工程、
ｆ）前記ｅ）の結果を、前記第１ポリマーのモノマー当たりの第２種プロトンの数で割る工程、および
ｇ）前記ｆ）の結果を、前記第１ポリマー中のモノマーの平均数で割る工程
を含み、それによって、前記溶液中の前記タンパク質－第１ポリマーコンジュゲートに共有結合した前記第１ポリマーの平均数を決定する、方法。
続きを表示（約 1,100 文字）【請求項２】
前記方法が、前記ｅ）またはｆ）またはｇ）の結果をＫ
ＮＭＲ
で割る工程をさらに含み、前記Ｋ
ＮＭＲ
が、標準物質または検量線または代替アッセイから得られる、請求項１に記載の方法。
【請求項３】
前記較正する工程が、前記ｃ）の結果を、前記タンパク質－第１ポリマーコンジュゲート中の第１種プロトンの数と等しくすることを含む、請求項１に記載の方法。
【請求項４】
前記ｃ）の積分する工程が固定され、かつ
前記ｅ）の積分する工程が固定される、
請求項１に記載の方法。
【請求項５】
前記ｃ）の積分する工程が、前記第１種プロトンピークを中心とし、かつ
前記ｅ）の積分する工程が、前記第２種プロトンピークを中心とする、
請求項１に記載の方法。
【請求項６】
前記ｂ）が、前記
１
Ｈ核磁気共鳴の測定値を、
フーリエ変換で、
自動位相補正で、
自動ベースライン補正で、
約０．０１～１０Ｈｚの線幅拡大窓関数で、
指数窓関数で、および
ＤＳＳ軸較正で
処理することを含む、請求項１に記載の方法。
【請求項７】
前記ａ）が、前記
１
Ｈ核磁気共鳴の測定を、
約１５℃～３５℃の温度で、
約１６回～約１０，０００回のスキャンで、
約＋１０ｐｐｍ～約－４ｐｐｍのスペクトル幅で、
約０．１秒間～約１２０秒間の繰り返し遅延時間で、および
最適化されたレシーバーゲインで
実施することを含む、請求項１に記載の方法。
【請求項８】
前記第１種プロトンピークが、前記タンパク質－第１ポリマーコンジュゲート中の前記少なくとも１つのアミノ酸の前記側鎖上の前記少なくとも１つのプロトンによって生成されたシグナルから本質的になる、請求項１に記載の方法。
【請求項９】
前記第１種プロトンピークが、バリンのメチル基上の６個のプロトン、およびロイシンのメチル基上の６個のプロトン、およびイソロイシンのメチル基上の６個のプロトン、およびイソロイシンのメチン基上のプロトンによって生成されたシグナルを含む、請求項１に記載の方法。
【請求項１０】
前記第１種プロトンピークが、バリンのメチル基上の６個のプロトン、およびロイシンのメチル基上の６個のプロトン、およびイソロイシンのメチル基上の６個のプロトン、およびイソロイシンのメチン基上のプロトンによって生成されたシグナルから本質的になる、請求項１に記載の方法。
（【請求項１１】以降は省略されています）
発明の詳細な説明【技術分野】
【０００１】
優先権主張
本出願は、２０２０年２月２４日に出願された米国仮出願第６２／９８０，７５７号に対する利益を主張し、その全体が参照により本明細書に援用される。
続きを表示（約 1,700 文字）【背景技術】
【０００２】
タンパク質修飾は、生理活性分子の薬物動態特性を高めるために長年使用されてきた。タンパク質に結合したポリエチレングリコール（ＰＥＧ）、ポリシアル酸（ＰＳＡ）、デキストラン、ヒドロキシエチルスターチ（ＨＥＳ）、およびそれらの誘導体などの水溶性ポリマーは、修飾分子の水溶性を劇的に向上させ、遮蔽効果により免疫原性を低下させ、生体分子をタンパク質分解酵素から保護し、そのすべてにより、インビボでの半減期が効果的に延長し得る。多数の長期作用性治療用タンパク質が市場に出回っており、それらのほとんどはＰＥＧ化技術に基づいている（Ｔｕｒｅｃｅｋｅｔａｌ．，Ｊ．Ｐｈａｒｍ．Ｓｃｉ．２０１６，１０５，４６０－４７５（非特許文献1））。
【０００３】
これらのコンジュゲートの分析特性評価の重要なパラメーターの１つは、修飾度（ｍｏｄｉｆｉｃａｔｉｏｎｄｅｇｒｅｅ）（タンパク質に結合した水溶性ポリマーの数）である。これらのコンジュゲートの修飾度を取得することは、工業生産プロセスを監視し、製品の品質を一致させるために重要である。
【０００４】
ポリマー－タンパク質コンジュゲートにおけるタンパク質に結合したポリマーの数（修飾度）の測定
従来、修飾度の決定には、少なくとも２つまたは３つの実験的測定を伴っていた。
【０００５】
まず、試料中のコンジュゲートのタンパク質濃度が確認された。タンパク質濃度を決定することができるアッセイには、蛍光／分光光度アッセイ、Ｌｏｗｒｙアッセイ、ビシンコニン酸（ＢＣＡ）アッセイ、Ｂｒａｄｆｏｒｄアッセイ、銅イオンベースのアッセイ、ならびに他のいくつかのＵＶおよび比色タンパク質アッセイが含まれる。
【０００６】
第二に、試料中のコンジュゲート中の水溶性ポリマーの濃度が確認された。試験は、結合したポリマーの種類に依存し、各ポリマーには固有のアッセイがある。一部のアッセイでは、水溶性ポリマーの濃度は、試料中の総水溶性ポリマーを実験的に測定し、試料中の遊離水溶性ポリマーも実験的に測定することによって決定される。
【０００７】
例えば、タンパク質試料中のＰＳＡの濃度は、レゾルシノールアッセイによって測定される。このアッセイでは、ポリマーは、強酸性条件下で完全に加水分解され、各モノマーとレゾルシノールとの間の着色錯体の形成が、光度測定によって監視される。最終的なＰＳＡの濃度は、検量線を使用して決定することができる。このアッセイの欠点は、分析の過程で試料が破壊されることである。
【０００８】
別の例として、ＰＥＧの濃度は、ＨＰＬＣベースの方法によって決定される。このアッセイの欠点は、分析の過程で試料が破壊されることである。
【０００９】
各実験的測定は、ある程度の誤差を導入し、得られた値の精度を低下させる。これらの誤差は、高純度の医薬品が求められる場合、重大な結果をもたらす可能性がある。得られた値の精度を欠くと、適合品のリリースを保証するために、リリースパラメーターの正しい値および／または厳格なリリース仕様を決定するのに複数の試験が必要になる場合がある。より厳格なリリース仕様により、製品の望ましいバッチが、不必要に破棄される場合がある。タンパク質の修飾度の目標レベルを決定する際に精度を欠くと、ポリマー－タンパク質カップリングの最適条件を決定することがより難しくなり、確認のために複数の試験が必要になる場合がある。そのため、精度を欠くと、ポリマー－タンパク質コンジュゲートの最適な製造プロセスの開発にかかる時間が長くなる可能性もある。精度の欠如は、開発される製品にも影響を与えかねない。
【００１０】
実験的測定の回数が減った高精度の修飾度分析を提供することにより、工業生産プロセスにおける品質管理分析が改善される。この利点および他の利点が、本明細書に記載の発明によって提供される。
【先行技術文献】
【非特許文献】
（【００１１】以降は省略されています）

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