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公開番号2025094280
公報種別公開特許公報(A)
公開日2025-06-25
出願番号2022008057
出願日2022-01-21
発明の名称細胞シート
出願人国立大学法人大阪大学,株式会社ステムリム
代理人個人,個人,個人
主分類C12N 5/10 20060101AFI20250618BHJP(生化学;ビール;酒精;ぶどう酒;酢;微生物学;酵素学;突然変異または遺伝子工学)
要約【課題】栄養障害型表皮水疱症の患者の皮膚に移植される細胞シート、およびその製造方法を提供する。
【解決手段】この細胞シートは、栄養障害型表皮水疱症の患者の水疱内の体液から採取された細胞で構成される。この細胞には、VII型コラーゲン遺伝子が導入されている。
【選択図】なし
特許請求の範囲【請求項１】
栄養障害型表皮水疱症の患者の水疱内の体液に由来し、VII型コラーゲン遺伝子が導入された細胞を含み、栄養障害型表皮水疱症の患者の皮膚に移植されることを特徴とする細胞シート。
続きを表示（約 910 文字）【請求項２】
細胞には、VII型コラーゲン遺伝子発現カセットが導入されており、
VII型コラーゲン遺伝子発現カセットは、EF1αプロモーターと、EF1αプロモーターの下流に配置されたCOL7A1遺伝子とを含む、請求項１に記載の細胞シート。
【請求項３】
細胞がシートの厚さ方向に重なり合っている、請求項１に記載の細胞シート。
【請求項４】
細胞シートの縦断面では、シートの表面近傍の細胞密度が、シートの中心部の細胞密度よりも高い、請求項３に記載の細胞シート。
【請求項５】
表皮が欠損した部分に移植される、請求項１に記載の細胞シート。
【請求項６】
栄養障害型表皮水疱症の患者の皮膚に移植される細胞シートの製造方法であって、
栄養障害型表皮水疱症の患者の水疱内の体液の少なくとも一部分を、培地に播種する工程と、
培養容器の底に付着した細胞を得る工程と、
前記細胞にVII型コラーゲン遺伝子を導入する工程と、
VII型コラーゲン遺伝子が導入された細胞を培養する工程と、
培養した細胞を培養容器から細胞シートとして取り出す工程と、
を有することを特徴とする細胞シートの製造方法。
【請求項７】
水疱内の体液から得た細胞を、酵素処理しないで培地に播種する、請求項６に記載の細胞シートの製造方法。
【請求項８】
レンチウイルスベクターを用いて細胞にVII型コラーゲン遺伝子を導入する、請求項６に記載の細胞シートの製造方法。
【請求項９】
VII型コラーゲン遺伝子が導入された細胞をオーバーコンフルエントとなるように播種する工程をさらに含む、請求項６に記載の細胞シートの製造方法。
【請求項１０】
1x10
4
cells/cm
2
以上の細胞密度で、VII型コラーゲン遺伝子が導入された細胞を培養容器に播種する工程をさらに含む、請求項６に記載の細胞シートの製造方法。
（【請求項１１】以降は省略されています）
発明の詳細な説明【技術分野】
【０００１】
本開示は、細胞シートに関する。
続きを表示（約 6,200 文字）【背景技術】
【０００２】
表皮水疱症は、皮膚組織の接着を担っている接着構造分子が欠損または消失していることにより、皮膚に力が加わると、表皮が真皮から剥がれて水ぶくれ（水疱）や皮膚潰瘍を生じる疾患である。このうち、表皮が千切れて水疱ができる病型は単純型表皮水疱症、表皮と基底膜の間が剥がれて水疱ができる病型は接合部型表皮水疱症、基底膜と真皮の間が剥がれる病型は栄養障害型表皮水疱症と称される。
【０００３】
栄養障害型表皮水疱症は表皮水疱症全体の約５割と最も多い病型であり、VII型コラーゲンをコードするCOL7A1遺伝子の変異を原因とする遺伝性疾患である。皮膚の構造において、表皮の一番下にある表皮基底細胞は、基底膜と称されるシート様の構造体と結合している。VII型コラーゲンは、真皮内でアンカリングフィブリルという線維を形成し基底膜と真皮をつなげている。このため、VII型コラーゲン遺伝子に異常があると基底膜と真皮の接着機能が損なわれ基底膜と真皮の間で水疱ができる栄養障害型表皮水疱症となる。栄養障害型表皮水疱症のなかでも、重症劣性栄養障害型表皮水疱症は、生直後より全身熱傷様皮膚症状が続き、３０歳前後より高率に皮膚有棘細胞癌（瘢痕癌）が多発して死に至る、極めて重篤な遺伝性水疱性皮膚疾患である。
【０００４】
表皮水疱症に対して、現在有効な治療法はなく、根治的に水疱形成を抑制する遺伝子治療法の開発が求められている。このような遺伝子治療として、患者の皮膚細胞を採取し、VII型コラーゲンを産生するよう遺伝子操作した後、培養して皮膚シートを形成し、患者に移植する治療技術が開示されている（特許文献１参照）。また、VII型コラーゲンの活性が失活している間葉系幹細胞に対してゲノム編集を施し、VII型コラーゲンを産生可能となった間葉系幹細胞をケラチノサイトや線維芽細胞に分化させると共に、培養して皮膚シートを形成し、患者の治療に用いることが提案されている（特許文献２参照）。
【先行技術文献】
【特許文献】
【０００５】
国際公開第２０１７/１２０１４７号公報
国際公開第２０１８/１５４４１３号公報
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００６】
本願は、栄養障害型表皮水疱症の治療に有効な細胞シートを提供する。
【課題を解決するための手段】
【０００７】
本発明の細胞シートの一態様は、栄養障害型表皮水疱症の患者の水疱内の体液から得られ、VII型コラーゲン遺伝子が導入された細胞で構成される。この細胞シートは、栄養障害型表皮水疱症の患者の皮膚に適用される。
【０００８】
細胞シートの製造方法の一態様では、まず、栄養障害型表皮水疱症の患者の水疱内の体液を、培地に播種する。次いで、培養容器の底に付着した細胞を取得する。次いで、この細胞にVII型コラーゲン遺伝子を導入する。次いで、このVII型コラーゲン遺伝子が導入された細胞を培養する。最後に、培養した細胞を培養容器から細胞シートとして取り出す。
【発明の効果】
【０００９】
本発明は、栄養障害型表皮水疱症の治療に有用である。
【図面の簡単な説明】
【００１０】
図１は、水疱由来細胞から細胞シートを作成する作業の概略を示す工程図である。
図２は、培養開始20日後までの水疱由来細胞の外観を示す写真である。
図３は、水疱由来細胞とヒト骨髄由来間葉系幹細胞のFACS解析の結果を示す。
図４は、栄養障害型表皮水疱症患者の水疱由来細胞とヒト骨髄由来間葉系幹細胞を、骨芽細胞、脂肪細胞、軟骨細胞への分化誘導条件下で培養し、それぞれアルカリホスファターゼ（ALP）染色、オイルレッドO染色、アルシアンブルー染色を行った結果を示す。
図５は、各種細胞のVII型コラーゲン発現量および分泌量を示す。図５（上）は、細胞のライセートに対して抗VII型コラーゲン抗体を用いてウエスタンブロットを行った結果を示す写真（左）および得られたバンドの濃さを定量化したグラフ（右）である。図５（下）は、細胞を培養した培地に対してウエスタンブロットを行った結果を示す写真（左）および得られたバンドの濃さを定量化したグラフ（右）である。「KC」はヒト表皮角化細胞を示す。「FB」はヒト皮膚線維芽細胞を示す。「MSC」はヒト骨髄由来間葉系幹細胞を示す。「BFC」は水疱由来細胞を示す。
図６は、設計したsgRNA（sgAAVS1-#1～#3）によるゲノムDNAの切断およびその切断効率を示す。
図７は、AAVS1領域にCOL7A1遺伝子を導入するゲノム編集の説明図である。HA-RおよびHA-Lは相同配列部分、SAはスプライスアクセプター配列、T2AはT2AペプチドをコードするT2A配列、Puroはピューロマイシン耐性遺伝子、CAGはCAGプロモーター配列を示す。野生型ゲノム（上）でのF2からR2までの長さは1952bp、COL7A1遺伝子が導入されたゲノム（下）でのF1からR1までの長さは1246bp、F2からR2までの長さは14249bpである。
図８は、各種細胞にCRISPR-Cas9でCOL7A1遺伝子を導入した後のVII型コラーゲンの発現および分泌量を示す。図８（上）は、細胞のライセートに対して抗VII型コラーゲン抗体を用いてウエスタンブロットを行った結果を示す写真（左）および得られたバンドの濃さを定量化したグラフ（右）である。図８（下）は、細胞を培養した培地に対してウエスタンブロットを行った結果を示す写真（左）および得られたバンドの濃さを定量化したグラフ(右）である。「FB」はヒト皮膚線維芽細胞を示す。「MSC」はヒト骨髄由来間葉系幹細胞を示す。「BFC」は水疱由来細胞を示す。
図９は、各種細胞にGFPレンチウイルスベクターを感染させて７２時間経過後の蛍光顕微鏡写真である。「GFP」は、細胞の緑色蛍光を示す写真である。「merge」は、「GFP」の写真に明視野の写真を重ね合わせたものである。「MOI 1」では、細胞にレンチウイルスベクターをMOI 1で感染させた。「MOI 5」では、細胞にレンチウイルスベクターをMOI 5で感染させた。「BFC」は水疱由来細胞の写真であり、「MSC」はヒト骨髄由来間葉系幹細胞の写真であり、「NHDF」は正常成人皮膚線維芽細胞の写真である。
図１０は、各細胞種にMOI 1でGFPレンチウイルスベクターを感染させて72時間経過後の細胞のGFP陽性率を示すグラフである。
図１１は、プラスミドマップである。図１１（左）は、本発明者が作成したプラスミド、pLVSIN-EF1α-COL7A1の構造を示す。図１１（右）は、本発明者が作成したプラスミド、pLVSIN-PGK-COL7A1の構造を示す。pLVSINベクターは、SIN（self-inactivating）型のレンチウイルスベクタープラスミドで、EF1αプロモーター（左）またはPGKプロモーターに（右）よって、ヒトVII型コラーゲン遺伝子を発現する。
図１２は、本発明者が製造したレンチウイルスベクターの遺伝子構造を示す模式図である。図１２（上）に示すLVSIN-EF1α-COL7A1ベクターは、EF1αプロモーターとCOL7A1遺伝子を発現カセットに備える。図１２（下）に示すLVSIN-PGK-COL7A1ベクターは、PGKプロモーターとCOL7A1遺伝子を発現カセットに備える。本ベクターは、HIV-1 LTR（5'LTRおよび3'LTR/ΔU3）とパッケージングシグナル（ψ）に加えて、導入遺伝子の発現やウイルス力価などを向上させるためにWPRE（ウッドチャック肝炎ウイルス転写後調節エレメント）、cPPT/CTS（セントラルポリプリン配列/セントラルターミネーション配列）、およびRRE（Rev応答エレメント）を含む。
図１３は、水疱由来細胞にEF1α-COL7A1レンチウイルスベクターを感染させて14日経過後に抗VII型コラーゲン抗体を用いて免疫染色した写真である。「DAPI」は、DAPI染色の写真である。「EF1a-C7」は、VII型コラーゲンに対する免疫染色の結果を示す写真である。「mock」では、細胞にレンチウイルスベクターを感染させなかった。「MOI 0.5」「MOI 1」「MOI 2」では、細胞にレンチウイルスベクターを、それぞれMOI 0.5, MOI 1, MOI 2で感染させた。
図１４は、水疱由来細胞にPGK-COL7A1レンチウイルスベクターを感染させて14日経過後に抗VII型コラーゲン抗体を用いて免疫染色した写真である。「DAPI」は、DAPI染色の写真である。「PGK-C7」は、VII型コラーゲンに対する免疫染色の結果を示す写真である。「mock」では、細胞にレンチウイルスベクターを感染させなかった。「MOI 0.5」「MOI 1」「MOI 2」では、細胞にレンチウイルスベクターを、それぞれMOI 0.5, MOI 1, MOI 2で感染させた。
図１５は、水疱由来細胞をVII型コラーゲン遺伝子搭載レンチウイルスベクターで感染させ、14日経過後に抗VII型コラーゲン抗体を用いてFACS解析した結果を示す。「EF1a-C7」では、EF1αプロモーターとCOL7A1遺伝子を発現カセットに備えるレンチウイルスベクターで、水疱由来細胞を感染させた。「PGK-C7」では、PGKプロモーターとCOL7A1遺伝子を発現カセットに備えるレンチウイルスベクターで、水疱由来細胞を感染させた。「mock」では、細胞にレンチウイルスベクターを感染させなかった。「MOI 0.5」、「MOI 1」、および「MOI 2」では、細胞にレンチウイルスベクターを、それぞれMOI 0.5、MOI 1、およびMOI 2で感染させた。
図１６は、図１５に示すFACSデータを定量化したグラフである。図１６（左）は、VII型コラーゲン陽性細胞率を示す棒グラフである。図１６（右）は、VII型コラーゲン陽性細胞の平均蛍光強度を示す棒グラフである。
図１７は、VII型コラーゲン遺伝子搭載レンチウイルスベクターを感染させた水疱由来細胞のゲノム中のベクターコピー数の経時変化を示すグラフである。
図１８（上段）は、作成した細胞シートの写真である。図１８（下段）は、作成した細胞シートを表皮水疱症モデルマウスに移植する手順を示すイラストおよび写真である。図１８（上段左）は、作成した細胞シートをプレートから剥離している途中の写真である。図１８（上段真ん中）は、プレートから剥離した細胞シートの写真である。図１８（上段右）は、作成した細胞シートのヘマトキシリン・エオジン染色の縦断面顕微鏡写真である。図１８（下段左）は、作成した細胞シートを表皮水疱症モデルマウスに移植する手順を示すイラストである。図１８（下段左から二番目）は、表皮水疱症モデルマウスの皮膚患部の写真である。図１８（下段右から二番目）は、表皮水疱症モデルマウスの皮膚患部の表皮を切開して、真皮を露出させた状態の写真である。図１８（下段右）は、表皮水疱症モデルマウスの創傷部位に、作成した細胞シートを貼付した直後の写真である。
図１９は、細胞シートを皮膚患部に移植した表皮水疱症モデルマウスの皮膚断層画像を示す。「DAPI」は、DAPI染色の写真である。「COL7」は、VII型コラーゲンに対する免疫染色の結果を示す写真である。「Merge」は、DAPI染色の結果とVII型コラーゲンに対する免疫染色の結果を重ねたものである。「細胞シート移植」は、CRISPR-Cas9を用いてCOL7A1遺伝子を導入した水疱由来細胞で作成した細胞シートを、皮膚患部に移植した結果を示す。「細胞懸濁液皮内投与」は、CRISPR-Cas9を用いてCOL7A1遺伝子を導入した水疱由来細胞の懸濁液を、皮膚患部に皮内投与した結果を示す。
図２０は、図１９と同様の結果を示す写真であり、図１９より高い倍率の顕微鏡写真である。
図２１は、水疱由来細胞シートを表皮水疱症モデルマウスの皮膚患部に移植して４週間経過後の皮膚に対してVII型コラーゲン免疫染色を行った後の蛍光強度を示すグラフである。
図２２は、細胞シートを皮膚患部に移植した表皮水疱症モデルマウスの皮膚に、in situ hybridizationと免疫染色を行った写真である。「Bright Field」は、VII型コラーゲンmRNAに相補的なプローブが可視化された明視野の写真である。「DAPI」は、DAPI染色の写真である。「COL7」は、VII型コラーゲンに対する免疫染色の結果を示す写真である。「Probe」は、プローブの蛍光標識を示す。「Merge」は、DAPI染色の結果とVII型コラーゲンに対する免疫染色の結果とプローブの蛍光標識の結果を重ねたものである。
図２３は、図２２と同様の実験を別の表皮水疱症モデルマウスに対して行った実験結果である。
図２４は、細胞シートを皮膚患部に移植した表皮水疱症モデルマウスの皮膚の電子顕微鏡写真である。「細胞シート移植」は、CRISPR-Cas9を用いてCOL7A1遺伝子を導入した水疱由来細胞で作成された細胞シートを、皮膚患部に移植した結果を示す。「細胞シートなし」は、細胞シートを移植しなかった表皮水疱症モデルマウスの皮膚患部を示す。「低倍率」は、25300倍の写真である。「低倍率」の写真の短辺は3.482μmであり、長辺は4.642μmである。「高倍率」は、84200倍の写真である。「高倍率」の写真の短辺は1.045μmであり、長辺は1.394μmである。
図２５は、細胞シートを皮膚患部に移植した表皮水疱症モデルマウスの皮膚断層画像を示す。「LVSIN-EF1α-COL7」は、発現カセットにEF1αプロモーターとCOL7A1遺伝子とを備えるレンチウイルスベクターで感染させた水疱由来細胞で作成された細胞シートを、皮膚患部に移植した結果を示す。「LVSIN-PGK-COL7」は、発現カセットにPGKプロモーターとCOL7A1遺伝子とを備えるレンチウイルスベクターで感染させた水疱由来細胞で作成された細胞シートを、皮膚患部に移植した結果を示す。
図２６（左）は、レンチウイルスベクターでCOL7A1遺伝子を導入した水疱由来細胞から作成された細胞シートを皮膚患部に移植した後、４週間経過後の基底膜におけるVII型コラーゲンの沈着距離を示すグラフである。図２６（右）は、蛍光強度を示すグラフである。
【発明を実施するための形態】
（【００１１】以降は省略されています）

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